【摘要】：目的：肝纖維化是肝臟受損后機(jī)體可逆的傷口愈合反應(yīng)階段，以ECM（extracellular matrix）沉積為特點(diǎn)。如果不及時(shí)治療，將會(huì)導(dǎo)致肝硬化的形成。所以抗肝纖維化治療具有非常重要意義，但是目前對(duì)肝纖維化的機(jī)制尚不明確。RHO信號(hào)通路主要是調(diào)節(jié)細(xì)胞收縮，遷移，增殖，形態(tài)以及基因的表達(dá)。這個(gè)信號(hào)通路與很多疾病密切相關(guān)，如血管痙攣，腎纖維化，神經(jīng)損傷，肺動(dòng)脈高壓等。所以RHO信號(hào)通路具有潛在的臨床治療價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)的目的是為了研究肝復(fù)康對(duì)肝纖維化時(shí)RHO信號(hào)通路干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究。 方法： 整體實(shí)驗(yàn)：健康的SD大鼠隨機(jī)被分為正常組，肝纖維化模型組及三組藥物治療組。正常組予皮下注射生理鹽水（0.5ml/kg），其余各組予等體積橄欖油稀釋的10%CCl4皮下注射，每周兩次，共12周。三組康復(fù)康中藥處理組分別為：高劑量組（3125mg/kg/day），，中劑量組（312.5mg/kg/day）及低劑量組（31.25mg/kg/day）。在第九周開(kāi)始給大鼠予肝復(fù)康高、中、低劑量治療。正常組與模型組在12周末處死并迅速取出肝組織，中藥治療組于第20周處死并取出肝組織，立即儲(chǔ)存于-70OC冰箱中。HE染色法觀察肝組織病理結(jié)構(gòu)的變化，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測(cè)組織中RHOA，ROCKI,FAK, vinculin的mRNA水平的表達(dá)，免疫組織化學(xué)和免疫蛋白印記法（werstern blot）檢測(cè)組織中ROCKI蛋白水平的表達(dá)。 離體實(shí)驗(yàn)：HSC-T6細(xì)胞培養(yǎng)在加入了10%胎牛血清，100U/ml青霉素G及100U/ml鏈霉素的DEMN培養(yǎng)基中，并置于孵育箱中培養(yǎng)（37OC，5%CO2及95%O2）。每?jī)商鞊Q液一次。細(xì)胞傳代后，實(shí)驗(yàn)在呈指數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為三組：正常對(duì)照組（DEMN培養(yǎng)液+10%正常大鼠血清+HSC細(xì)胞），模型組（DEMN培養(yǎng)液+終濃度200umol/L乙醛+10%正常大鼠血清+HSC細(xì)胞），肝復(fù)康治療組（DEMN培養(yǎng)液+終濃度200umol/L乙醛+10%肝復(fù)康中劑量組大鼠血清+HSC細(xì)胞）。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）法檢測(cè)細(xì)胞中RHOA，ROCKI,FAK, vinculin的mRNA水平的表達(dá)，免疫蛋白印記法（werstern blot）檢測(cè)細(xì)胞中ROCKI在蛋白水平的表達(dá)。 結(jié)果： （1）肝復(fù)康對(duì)大鼠肝組織中RHO信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)的影響：HE染色觀察到正常肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索呈放射狀排列，肝細(xì)胞形態(tài)正常，無(wú)脂肪空泡。模型組可見(jiàn)假小葉生成，正常肝小葉被破壞，多數(shù)肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。中藥治療組肝組織纖維化表現(xiàn)不同程度的改善，以中劑量組最為明顯。RT-PCR結(jié)果顯示，在肝組織中RHO通路相關(guān)因子RHOA,ROCKI,FAK,vinculin在模型組均有明顯表達(dá)，而在正常組表達(dá)極少，肝復(fù)康治療組均使以上因子不同程度的下調(diào)，而中劑量治療效果最為明顯。免疫組織化學(xué)和western blot結(jié)果顯示，在正常組ROCKI蛋白表達(dá)很微弱，而在模型組ROCKI的表達(dá)明顯上調(diào)，中藥治療組均不同程度的使ROCKI表達(dá)下調(diào)，以中劑量治療組最為明顯，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 （2）肝復(fù)康對(duì)大鼠HSC-T6細(xì)胞株中RHO信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)影響：RT-PCR結(jié)果顯示，RHO通路相關(guān)因子RHOA,ROCKI,FAK, vinculin在乙醛組均有明顯表達(dá)，而在正常組表達(dá)極少，肝復(fù)康中劑量治療組均使以上因子不同程度的下調(diào)，western blot結(jié)果顯示，在正常組ROCKI蛋白表達(dá)很微弱，而在乙醛組ROCKI的表達(dá)明顯上調(diào)，肝復(fù)康中劑量治療組ROCKI表達(dá)明顯減少，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 結(jié)論：1.RHO信號(hào)通路可能通過(guò)調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞的增殖，遷移，粘附促進(jìn)肝纖維化。 2.肝復(fù)康對(duì)肝纖維化有明顯的治療作用，其機(jī)制可能與抑制RHO信號(hào)通路有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R285.5;R575.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2754694