【摘要】：非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除外病毒、藥物、酒精等因素，主要特征為肝細(xì)胞內(nèi)的脂肪過(guò)度沉積，發(fā)生脂肪變性的病理綜合征。NAFLD與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關(guān)，是獲得性代謝應(yīng)激性肝損傷相關(guān)疾病。NAFLD包括非酒精性單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及其相關(guān)肝纖維化等系列疾病譜。它的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前主要學(xué)說(shuō)為“二次打擊”理論[1]�，F(xiàn)有研究和本課題組以往研究均提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與NAFLD發(fā)病過(guò)程，啟動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的因素有很多,但相關(guān)調(diào)控機(jī)制尚不明確。此外，NAFLD病程進(jìn)程中，肝細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡等病理改變，其發(fā)生機(jī)制也不明確[2]。 磷酸弗林蛋白酶酸性氨基酸簇選蛋白(Phosphofurin Acidic Cluster Sortingprotein，PACS)家族是多功能蛋白家族，其成員包括PACS-1和PACS-2[3]。PACS-1定位于高爾基體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間[4]，而PACS-2則定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體之間，分別參與調(diào)節(jié)相應(yīng)細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)與功能聯(lián)系[5]。其中，PACS-2定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)線粒體相關(guān)膜(Mitochondria-Associated Membrane，MAM)，在調(diào)控細(xì)胞凋亡，鈣粒子轉(zhuǎn)運(yùn)和脂質(zhì)代謝與轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要作用。然而，PACS-2在NAFLD發(fā)生發(fā)展中的表達(dá)及意義尚并不明確，因此我們研究了PACS-2在非酒精性脂肪性肝病中的表達(dá)變化，并初步探討其可能作用。 方法 1. HepG2肝細(xì)胞脂肪變模型 使用a-MEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)培養(yǎng)HepG2細(xì)胞至匯合度80%以上。建模前一天，換無(wú)胎牛血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜。對(duì)照組細(xì)胞：a-MEM加1%牛血清白蛋白(不含脂肪酸）培養(yǎng)基處理(0h組)。脂肪變細(xì)胞：a-MEM加1%牛血清白蛋白(不含脂肪酸）培養(yǎng)基處理，添加500μM/L(微摩爾/升)的軟脂酸鈉。脂肪變模型根據(jù)誘導(dǎo)時(shí)間分為4h,8h,12h和24h等時(shí)間點(diǎn)。采用油紅O染色顯示胞內(nèi)脂滴，顯微鏡觀察細(xì)胞脂肪變程度[1]。 2. NAFLD大鼠模型 選用4周齡雄性SD大鼠42只(體重170 210g),隨機(jī)分為基礎(chǔ)飼料組(對(duì)照組)、高脂飼料組(模型組)，分別于喂養(yǎng)分別于4周,8周,12周,16周,20周，每個(gè)時(shí)相點(diǎn)各收集大鼠6只采集標(biāo)本。大鼠稱重并麻醉，留取肝組織標(biāo)本，部分制成石蠟切片，行HE染色；部分-70℃儲(chǔ)存用于western blot檢測(cè)。 3. Real-time PCR試驗(yàn) Real-time PCR檢測(cè)脂肪變HepG2細(xì)胞中PACS-2及其所調(diào)控的相關(guān)分子的mRNA水平表達(dá)，包括葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(Glucose Regulated Protein78, GRP78)、細(xì)胞凋亡標(biāo)志蛋白Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2Associated X Protein，Bax)和含半胱氨酸的冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase3，Caspase-3)。 4. Western-blot試驗(yàn) Western-blot檢測(cè)脂肪變HepG2細(xì)胞和NAFLD大鼠肝組織中PACS-2、GRP78、Bax和Caspase-3的蛋白表達(dá)水平。 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用SPSS軟件13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P0.05為差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1.軟脂酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生脂肪變性 我們采用油紅O染色檢測(cè)HepG2細(xì)胞脂肪變性程度。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，油紅O染色使脂滴呈現(xiàn)為紅色。軟脂酸處理時(shí)間延長(zhǎng), HepG2細(xì)胞胞漿內(nèi)脂滴明顯增多,且脂滴呈現(xiàn)逐漸增大，相互融合的現(xiàn)象。這些結(jié)果表明，軟脂酸處理HepG2細(xì)胞可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性。 2.高脂飲食導(dǎo)致SD大鼠發(fā)生NAFLD 大鼠肝組織切片，HE染色發(fā)現(xiàn)，隨著高脂飲食時(shí)間延長(zhǎng)，大鼠肝組織逐漸出現(xiàn)脂肪變。隨喂養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，大鼠肝組織進(jìn)行性加重，出現(xiàn)肝小葉內(nèi)炎癥及肝纖維化等病理改變。這些結(jié)果表明，高脂飲食成功建立了NAFLD大鼠模型。 3. Real-timePCR檢測(cè)脂肪變HepG2細(xì)胞中PACS-2、GRP78、Bax和Caspase-3mRNA的表達(dá)水平 Real-timePCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PACS-2mRNA相對(duì)表達(dá)量在細(xì)胞脂肪變性的早期下降(4h，P0.01；8h，P0.05)，而后期則顯著增加(12h，P0.01；24h， P0.01)。細(xì)胞脂肪變性后12h和24h，GRP78、Bax和Caspase-3三者mRNA的相對(duì)表達(dá)量比未發(fā)生脂肪變性的細(xì)胞均顯著升高(三者P0.01)。 4. Western-blot檢測(cè)脂肪變HepG2細(xì)胞與NAFLD大鼠肝組織中PACS-2、GRP78、Bax和Caspase-3的蛋白表達(dá)變化 Western-blot檢測(cè)表明，與未發(fā)生脂肪變性的細(xì)胞比，HepG2細(xì)胞脂肪變性4h后PACS-2表達(dá)顯著下調(diào)(P0.01)，而脂肪變性12h和24h后則顯著上升。此外，細(xì)胞脂肪變性后12h和24h，GRP78、Bax和Caspase-3三者表達(dá)量均顯著上調(diào)(P0.01)。 在高脂飲食誘導(dǎo)大鼠NAFLD過(guò)程中，早期(8w）PACS-2表達(dá)顯著降低(P0.01)，而晚期(16W、20W)則顯著上升(P0.01)。GRP78在早期(8w)即表現(xiàn)為顯著上調(diào)(P0.01)，之后持續(xù)升高, Bax和Caspase-3則在晚期(16w、20w)才出現(xiàn)有顯著上調(diào)(P0.01)。 結(jié)論 1.無(wú)論在細(xì)胞模型或動(dòng)物模型，肝細(xì)胞脂肪變性過(guò)程中PACS-2表達(dá)動(dòng)態(tài)變化，規(guī)律是早期表達(dá)降低，后期表達(dá)升高；GRP78表達(dá)在早期即升高并持續(xù)高表達(dá), Bax和Caspase-3則只有到后期才出現(xiàn)顯著升高。 2.肝細(xì)胞脂肪變?cè)缙诔霈F(xiàn)PACS-2低表達(dá)可能參與了NAFLD內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，其在晚期升高可能與肝細(xì)胞凋亡所致肝損傷相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R575.5
【圖文】：

圖 1-1 0hHepG2 細(xì)胞中未見(jiàn)明顯脂滴。油紅 O 染色 (x400)圖 1-2 4h少數(shù)細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)直徑較小的脂滴。圖 1-3 8h較多的細(xì)胞出現(xiàn)較多脂滴，在細(xì)胞內(nèi)脂滴直徑也較前有所增大。油紅 O 染色 (x400)圖 1-4 12h更多的細(xì)胞脂肪變，一些細(xì)胞中的脂滴增大，并相互融合。油紅 O 染色 (x400)

圖 1-1 0hHepG2 細(xì)胞中未見(jiàn)明顯脂滴。油紅 O 染色 (x400)圖 1-2 4h少數(shù)細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)直徑較小的脂滴。圖 1-3 8h較多的細(xì)胞出現(xiàn)較多脂滴，在細(xì)胞內(nèi)脂滴直徑也較前有所增大。油紅 O 染色 (x400)圖 1-4 12h更多的細(xì)胞脂肪變，一些細(xì)胞中的脂滴增大，并相互融合。油紅 O 染色 (x400)

圖 1-3 8h較多的細(xì)胞出現(xiàn)較多脂滴，在細(xì)胞內(nèi)脂滴直徑也較前有所增大。油紅 O 染色 (x400)圖 1-4 12h更多的細(xì)胞脂肪變，一些細(xì)胞中的脂滴增大并相互融合。油紅 O 染色 (x400)圖 1-5 24h幾乎所有細(xì)胞都有明顯的脂滴，部分有融合。油紅 O 染色 (x400)

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 王春華;陳東風(fēng);;線粒體通透轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放與NAFLD大鼠肝細(xì)胞凋亡的關(guān)系[J];重慶醫(yī)學(xué);2007年08期

2 閔敏;陳東風(fēng);王軍;艾正琳;樊麗琳;嚴(yán)麗麗;;葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78在大鼠非酒精性脂肪性肝炎中的表達(dá)及意義[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2009年01期

3 熊吉;王軍;樊麗琳;胡輅;蘭春慧;楊敏;孫文靜;陳東風(fēng);;Sigma-1受體在非酒精性脂肪性肝病中的表達(dá)及意義[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2011年08期

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本文編號(hào)：2746318