【摘要】：背景與目的：急性肝損傷的特征是短時間內(nèi)肝細胞大量變性、壞死并伴炎性細胞浸潤，其臨床治療成為棘手問題。因病毒、藥物、細菌、酒精及遺傳等因素引起的急慢性肝臟疾病極大危害著人們的健康。目前公認的治療急性重癥及中晚期肝病的最有效方法是肝移植，但因肝源不足、價格昂貴及移植后免疫排斥反應(yīng)等因素，應(yīng)用受到限制。骨髓間充質(zhì)干細胞（bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs）是來自中胚層的一群異質(zhì)細胞，自我復(fù)制能力強，并具有多向分化的潛能，在適宜的條件下可以分化為成骨、軟骨、脂肪細胞，甚至源于中胚層的心肌細胞、外胚層的神經(jīng)細胞和內(nèi)胚層的肝細胞。與胚胎干細胞相比，BMSCs因其取材方便，在適當條件下可大量擴增、低免疫排斥、無倫理學爭議、花費較低等特點成為組織工程和細胞治療的研究熱點。本實驗通過白酒一次性灌胃制備急性酒精性肝損傷大鼠模型，并用損傷肝臟組織勻漿培養(yǎng)第3代大鼠BMSCs，誘導其向肝細胞方向分化，來探討B(tài)MSCs在病理微環(huán)境下向肝細胞分化的可行性，了解BMSCs治療急性肝臟疾病的可能機制，為BMSCs臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 方法：（1）3～4周齡健康雄性SD大鼠，在LG-DMEM（含10%胎牛血清）培養(yǎng)體系下，采用完全貼壁法培養(yǎng)大鼠股骨、脛骨骨髓液獲得BMSCs，體外傳代；倒置相差顯微鏡下每日觀察BMSCs的生長情況及其形態(tài)學特點；MTT法檢測第3、6代細胞并繪制生長曲線，流式細胞法檢測細胞表面抗原CD34、CD29、CD105的表達。（2）400～500g健康雄性SD大鼠10只，隨機分為肝損傷組及對照組，每組5只，禁食不禁水12h，肝損傷組以56°紅星二鍋頭一次性經(jīng)口灌胃10ml/kg(折合酒精4.5g/kg)，對照組給予同等量生理鹽水灌胃，24h后處死大鼠，取肝臟組織進行組織學檢查。（3）取正常及肝損傷組大鼠肝臟，分別按肝臟濕重0.1g加1ml低糖DMEM完全培養(yǎng)基的比例冰上研磨制備肝臟組織勻漿。用損傷肝勻漿誘導第3代BMSCs分化，正常肝勻漿做對照，在第0、3、7、10、14、21天用RT-PCR和western blot法檢測AFP、ALB的表達。 結(jié)果：（1）原代細胞72首次換液后可見散在分布的長梭形細胞，之后細胞生長迅速，在第8-9天融合，傳代細胞生長迅速，形態(tài)均一，呈漩渦狀、魚群狀生長；生長曲線示細胞第1-2天為潛伏期，4-6天為增殖期，生長迅速，在第7-8天生長緩慢進入平臺期；細胞陽性表達CD29、CD105，陰性表達CD34。（2）肝損傷組大鼠肝臟病理呈明顯肝脂肪變性，對照組肝臟組織形態(tài)正常。（3）在損傷及正常肝勻漿誘導下，兩組BMSCs均從長梭形逐漸向多角形改變，第14天左右細胞出現(xiàn)肝細胞樣改變。兩組細胞均在第3天檢測到AFP的表達，表達量在第7天左右達到高峰后迅速下降，第14天時表達量極少；在第7天檢測到ALB的表達，且隨時間延長表達量逐漸增加，mRNA水平與蛋白水平表達一致。但損傷肝勻漿與正常肝勻漿誘導培養(yǎng)的細胞各時間點AFP和ALB的表達量無統(tǒng)計學差異（P0.05）。 結(jié)論：（1）完全貼壁法培養(yǎng)骨髓液可獲取骨髓間充質(zhì)干細胞，得到BMSCs純度較高，體外生長活性強，增殖旺盛。（2）禁食12h后，56°紅星二鍋頭一次性灌胃染毒大鼠，可成功制備大鼠急性酒精性肝損傷模型。（3）急性酒精性肝損傷大鼠的肝臟組織勻漿可以誘導BMSCs向肝細胞方向分化，但誘導效果與正常肝臟組織勻漿相近。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R575
【圖文】：

態(tài) 學特 征h 后， 可 見 培 養(yǎng) 液中 懸 浮 著大 量 圓 形 細胞 ，換 液 2～ 72 h 首次 換液 后可 見 皿 底 散在 分 布著 長梭 形 的 貼 壁 圓形 細 胞， 之 后細 胞 生 長 迅 速， 多 為 成 纖維 狀 細胞 放 射狀 生 長 ， 在 第 9 天左 右， 大 多數(shù) 細胞 克 隆 可 達傳 代 BM S Cs 分 布均 勻 （附 圖 3） ，形 態(tài) 均 一 ，多 為 渦狀 ， 傳代 細 胞 生長 迅速 ， 2h 內(nèi) 可 貼壁 ，約 3 - 4 天， 細 胞 變得 寬 大 扁平 ， 生 長速 度 減慢 （ 附 圖 4） 。 長曲 線

原代培養(yǎng)BMSCs第3天（x40）Fig1PrimarycultureofBMSCsatthe3d（x40）圖2原代培養(yǎng)BMSCs第8天（x40）Fig2PrimarycultureofBMSCsatthe8d（x40）

圖 4 P 6 代 B M S C s（ x4 0 ）F ig 4 T h e 6 th p a ss a g e cu lt u re （ x4 0 ）圖5急 性酒 精性 肝 損 傷肝 臟組 織H E染 色（ x1 0 0）F ig 5 A cu t e a

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