【摘要】：暴發(fā)性病毒肝炎（Fulminant viral hepatitis，F(xiàn)H)是病毒感染引起的大規(guī)模肝細胞壞死，嚴重的肝功能損害、肝性腦病等為特征的臨床綜合癥。常見于中國及其他HBV流行的亞洲國家，起病急，死亡率高，缺乏有效的治療手段。尋找有效的治療手段需要我們對其致病機制有更進一步的認識，對MHV-3誘導的暴發(fā)性肝炎模型的研究將有利于我們更進一步的認識暴發(fā)性肝炎的發(fā)病機制，為暴發(fā)性肝炎的臨床治療提供新的理論依據。 MHV-3是冠狀病毒科的單正鏈RNA病毒，敏感小鼠如Balb/c、C57/BL感染可在肝血竇形成血栓，致肝臟微循環(huán)改變，大量肝細胞缺血壞死，引起暴發(fā)性病毒肝炎且3-7天死亡，而A/J等耐受小鼠則對其完全耐受，不表現(xiàn)出任何臨床癥狀。敏感小鼠感染MHV-3后，單核巨噬細胞活化表達凝血酶原酶纖維介素（Fibrinogen like protein2/fibroleukin, FGL2），裂解凝血酶原為有活性的凝血酶，啟動凝血級聯(lián)反應，引起纖維蛋白沉積，血管內凝血，肝血竇血栓形成，肝細胞壞死。 B、T淋巴細胞衰減子（B and T lymphocyte attenuator，BTLA）是新近鑒定的具有抑制T細胞活化增殖的CD28免疫球蛋白超家族成員。BTLA與其配體皰疹病毒侵入受體（herpes virus entry mediator，HVEM）結合后可以抑制CMV特異的CD8+T細胞的活化增殖以及IL-2的分泌，在免疫應答的負性調節(jié)以及外周免疫耐受中發(fā)揮重要的作用。BTLA參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，如BTLA-/-小鼠對實驗性自身免疫性腦炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)，過敏性呼吸道炎癥以及自身免疫性肝炎等較WT小鼠更為敏感。BTLA在感染疾病中同樣發(fā)揮了重要作用，CMV感染中，BTLA在CMV特異的CD8+T細胞上高表達，阻斷BTLA信號，可增強CMV特異的CD8+T細胞的增殖，說明BTLA可抑制病毒特異性的CTL反應。對寄生蟲感染的研究發(fā)現(xiàn)，阻斷BTLA信號，可以加快機體對李斯特桿菌的清除。在我們的前期工作中發(fā)現(xiàn)，PD-1可以減輕MHV-3誘導的肝損傷。與WT小鼠相比，PD-1-/-小鼠MHV-3感染后肝臟病變更嚴重，死亡率更高，提示CD28家族成員參與了MHV-3誘導的暴發(fā)性肝炎。目前為止，BTLA在MHV-3誘導的暴發(fā)性肝炎還未知。 為明確BTLA在MHV-3誘導的暴發(fā)肝炎中的作用，我們以BTLA-/-和WT小鼠為研究對象，腹腔感染MHV-3后，比較兩組小鼠的生存曲線，肝臟病理，血清ALT、AST、FGL2。結果發(fā)現(xiàn)WT小鼠在感染后9天內全部死亡，而BTLA-/-小鼠在感染后20天仍有87.5%(7/8)的存活。HE染色發(fā)現(xiàn)感染后48hWT小鼠即有嚴重的肝細胞、脾細胞壞死，到72h更劇，而同時相的BTLA-/-小鼠肝臟、脾臟細胞均較正常。與HE結果一致，TUNEL分析可見WT小鼠大量肝細胞、脾細胞凋亡，而BTLA-/-凋亡較少。BTLA-/-小鼠血清ALT、AST顯著性低于感染后同時相WT小鼠。免疫雙熒光分析發(fā)現(xiàn)FGL2表達于CK18+的上皮細胞，F(xiàn)4/80+的巨噬細胞，CD11C+的DC細胞和CD31+的內皮細胞，少量表達于CD3+T細胞。BTLA-/-小鼠感染MHV-3后，血清FGL2顯著性低于WT小鼠；肝臟fgl2mRNA水平明顯低于WT小鼠；與mRNA一致，肝臟FGL2也明顯較WT少，纖維蛋白沉積也較少。本部分實驗結果提示，BTLA不是減弱，而是促進了MHV-3誘導的暴發(fā)性肝炎。BTLA基因敲除后可使小鼠FGL2表達顯著性降低，纖維素沉積減少，肝臟病理減輕，使MHV-3誘導的暴發(fā)性肝炎致死率降低。 為進一步明確BTLA促進MHV-3誘導的暴發(fā)性肝炎的作用機制，首先免疫熒光分析BTLA在器官中的表達，發(fā)現(xiàn)在肝臟、脾臟、淋巴結均有BTLA陽性細胞。流式分析發(fā)現(xiàn)MHV-3感染后，BTLA在CD4+T、CD8+T、B細胞上表達下調，而在巨噬細胞上顯著性上調。BTLA-/-和WT小鼠巨噬細胞表達相當量的共刺激分子，凋亡相關分子以及促炎細胞因子。MHV-3感染后，Annex-V/PI染色發(fā)現(xiàn)，BTLA-/-小鼠巨噬細胞的凋亡顯著性高于WT小鼠，進而BTLA-/-小鼠MHV-3感染24h，腹腔巨噬細胞，肝臟巨噬細胞頻率明顯低于WT小鼠；巨噬細胞體外感染MHV-3，TUNEL分析其凋亡也發(fā)現(xiàn)BTLA-/-小鼠巨噬細胞凋亡明顯高于WT巨噬細胞。本部分實驗結果提示，巨噬細胞上BTLA的表達維持了其存活，BTLA基因敲除后，MHV-3感染可導致巨噬細胞的凋亡增加，炎癥反應減輕，F(xiàn)GL2分泌減少，進而保護小鼠的肝臟免受損傷，提高了其生存率。 為明確巨噬細胞凋亡是否會導致炎癥因子的減少。我們以RT-PCR方法分析BTLA-/-和WT小鼠MHV-3感染后肝臟炎癥因子的mRNA，發(fā)現(xiàn)肝臟中TNF-α mRNA顯著性低于WT小鼠，而其他細胞因子，如IL-2、IL-4等變化不明顯。流式分析巨噬細胞單個水平TNF-α分泌情況，結果顯示BTLA-/-小鼠巨噬細胞TNF-α分泌顯著性高于WT小鼠，但由于BTLA-/-小鼠巨噬細胞凋亡顯著性高于WT小鼠，因此BTLA-/-小鼠血清TNF-α水平卻顯著性低于WT小鼠。MHV-3感染后，給BTLA-/-小鼠體內補充TNF-α重組蛋白，可使肝臟病變加重，血清ALT、AST、FGL2顯著增高，死亡率增高。TNF-α-/-小鼠感染MHV-3后，其死亡率、肝臟病變以及血清ALT、AST、FGL2等顯著性低于其野生型。這些結果表明，TNF-α在BTLA促進MHV-3誘導的暴發(fā)性肝炎中發(fā)揮了非常重要的作用，BTLA基因敲除后，MHV-3感染所致的巨噬細胞大量凋亡，導致體內TNF-α顯著性降低，F(xiàn)GL2分泌減少，肝臟病變減輕，死亡率減少。 為進一步明確巨噬細胞上BTLA分子的缺失是導致BTLA-/-小鼠對MHV-3耐受的主要原因，我們分選WT小鼠腹腔巨噬細胞，過繼回輸給感染了MHV-3的BTLA-/-小鼠，結果發(fā)現(xiàn)小鼠的死亡率明顯增高。WT小鼠感染MHV-3后，體內阻斷BTLA信號，可使小鼠的存活時間明顯延長，死亡率明顯減少。 綜上，在MHV-3誘導的暴發(fā)性肝炎中，BTLA通過調節(jié)巨噬細胞的存活，進而影響了肝臟病變的嚴重程度，小鼠的致死率。
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R575.1
【圖文】：

圖1-1：H&E分析肝臟病理，免疫組化分析肝組織中FGL2表達及纖維蛋白沉積情況。HBV-ACLF患者肝細胞壞死嚴重，大量CD68+細胞浸潤，F(xiàn)GL2表達及纖維蛋白沉積。Fig1-1：The morphology of liver biopsy from FH patients with HBV-ACLP, mild CHB and normalhealth was compared by H&E staining, and the expression of CD68 , FGL2 as well as Fibrinogendeposits was detected by immunohistochemistry.18

BTLA的表達，15例慢性乙型肝炎患者肝臟中有2例檢測出BTLA表達，其余沒有檢測到BTLA的表達，然而在HBV-ACLF患者中，3例肝組織均檢測到大量BTLA的表達，圖1-2。圖 1-2：免疫組化分析肝組織中 BTLA 表達。HBV-ACLF 肝組織中 BTLA 大量表達，而只有 2 例（共 15 例）慢乙肝患者肝組織中檢測出 BTLA，正常人肝組織中未檢出。Fig1-2：Immunohistochemistry showed that the expression of BTLA (A) was absence in normal healthliver tissues. (B) Very rare BTLA+cells were observed in mild CHB. (C) The expression of BTLA oninflammatory cell-like cells, (D) macrophage-like cells,(E) and benign bile ducts were observed in livertissues of HBV-ACLP. (F) Mouse IgG1 isotype control.三、 BTLA主要表達于CD68+細胞為更進一步明確BTLA的表達特征，我們通過免疫雙熒光染色分子BTLA與CD68、CD3、FGL2、CD31、CK18的共聚。結果如圖1-3所示，BTLA主要表達于肝組織中CD68+巨噬細胞、CK18的上皮細胞上，與FGL2共表達，而在CD3T細胞及CD31內皮細胞幾乎無表達。19

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