【摘要】：目的：構建pEGFP-N1-AQP7、pEGFP-N1-AQP9及pshRNA-AQP9重組質粒,驗證其在COS-7細胞中的表達情況,檢測其對L-02細胞AQP9表達的影響及其對L-02細胞脂肪變性的的作用,利用電穿孔的方法將重組質粒轉化進入減毒沙門氏菌構建重組SL7207疫苗株,為AQP7及AQP9在非酒精性脂肪肝病的基因治療奠定基礎。 方法：(1)從人脂肪組織及肝臟組織中提取總RNA,通過RT-PCR獲得AQP7及AQP9基因,將其克隆到pEGFP-N1質粒上,構建重組質粒pEGFP-N1-AQP7及pEGFP-N1-AQP9,將其轉染COS-7真核表達細胞,通過觀察綠色熒光蛋白的表達、]RT-PCR和Western blot檢測其在COS-7中的表達；(2)構建針對人AQP9的干擾質粒pshRNA-AQP9,將其轉染L-02肝細胞,通過RT-PCR和Western blot檢測其抑制效率；(3)將pEGFP-N1-AQP9及pshRNA-AQP9分別轉染油酸誘導脂肪變性的L-02細胞,檢測其對L-02細胞脂肪變性的作用；(4)通過電穿孔的方法將pEGFP-N1-AQP9及pshRNA-AQP9轉化減毒沙門氏菌SL7207并檢驗其表達情況和穩(wěn)定性。 結果：(1)通過RT-PCR獲得AQP7及AQP9基因片斷,成功構建重組質粒pEGFP-N1-AQP7及pEGFP-N1-AQP9,驗證了其在COS-7細胞中表達并與綠色熒光蛋白融合；(2)成功構建pshRNA-AQP9,并篩選出對L-02細胞AQP9干擾效果明顯的重組質粒；(3)成功建立L-02細胞脂肪變性模型,pEGFP-N1-AQP9及pshRNA-AQP9對其脂肪變性程度分別有加重及減輕作用；(4)成功構建重組SL7207疫苗株SL7207/pEGFP-N1-AQP9及SL7207/pshRNA-AQP9。 結論：通過油酸誘導建立L-02肝細胞脂肪變性模型,轉染pEGFP-N1-AQP9上調其AQP9的表達可使其脂肪變性程度加重,反之,轉染pshRNA-AQP9下調其AQP9表達能使其脂肪變性程度減輕,表明AQP9在L-02細胞脂肪變性中起重要作用。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R575.5
【圖文】：

脂肪組織及肝臟組織總RNAI%瓊脂糖凝膠電泳

155脂肪組織總RNA肝臟組織總RNA圖1一1脂肪組織及肝臟組織總RNAI%瓊脂糖凝膠電泳Figurel一 1TOtalRNAI%agarosegelelcctrol)horesisofadil)osetissueandlivertissue2.2RT一PCR擴增目的基因將Rl，~pCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，在 1O29bp及在888bp附近有特異性條帶，與實驗設計相一致，提示擴增產物為AQP7片段及AQPg片段，見圖卜2。231029飾673bP888卜P678卜P AQP7PCR產物圖1一ZAQP7及AQPgPCR產物 AQPgPCR產物2%瓊脂糖凝膠電泳Figurcl一 2The20/0agarosegelelectroPhorcsisofAQP7andAQPgPCRI)roduetion DNAMa人er(DLZ()()());2.3:RT~pCR產物 DNAMaker(DL2000);2.3;Rl’ -PCRProductlon2

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本文編號：2728156