【摘要】： 慢性肝臟疾病是一類世界性的嚴重危害人類健康的主要疾病,其中肝纖維化是這個過程的中間及關鍵環(huán)節(jié)。肝纖維化(hepatic fibrosis)是慢性肝病的共同病理學基礎,是形成肝硬化的必經病理階段,其特征是以膠原為主的細胞外間質(extracellular matrix,ECM)成分合成增多和/或降解相對不足而在肝內過量沉積。盡管不同肝病的發(fā)病機制有所不同,但其發(fā)生纖維化的最終途徑相似,其中最關鍵的環(huán)節(jié)是肝星狀細胞(hepatic stellate cells,HSCs)的激活。肝星狀細胞(hepatic stellate cell, HSC)是啟動整個事件的開端,在肝纖維化過程中扮演著重要的角色,誘導活化HSC的凋亡可使肝纖維化發(fā)生逆轉。越來越多的研究認為HSC活化和增殖與其凋亡受到抑制有關,而核因子-κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)與細胞凋亡關系密切。NF-κB是一種能與免疫球蛋白κ輕鏈基因的增強子κB序列特異合的蛋白因子,由Rel蛋白家族的成員以同源或異源二聚體形式組成,目前發(fā)現的哺乳動物的Rel蛋白包括p65 (RelA, NF-κB3)、p50 (NF-κB1)、Rel (c-Rel)、RelB和p52 (NF-κB2),其中p65/p50是發(fā)現最早的,分布最廣泛,主要發(fā)揮生理作用的NF-κB。NF-κB能與多種細胞基因啟動子或增強子序列特定位點發(fā)生特異性結合而促進轉錄和表達,與炎癥反應、免疫應答以及細胞的增生、轉化和凋亡等重要的病理生理過程密切相關。誘導活化HSC的凋亡可使肝纖維化發(fā)生逆轉。 雙環(huán)醇是中國醫(yī)學科學院藥物研究所研制的抗肝炎新藥,其化學名稱為6一甲氧羰基_l5一羥甲基一2,3,2 ,3一雙亞甲二氧基4,4一二甲氧基聯苯。以往研究表明,雙環(huán)醇對多種實驗性急、慢性肝損傷均有明顯保護作用。臨床用于治療慢性乙型、丙型病毒性肝炎已取得較好療效,且具有口服吸收好、不良反應少的特點,除此之外,雙環(huán)醇還可使肝纖維化大鼠血清ALT、AST、總膽紅素、透明質酸(HA)和Ⅲ型前膠原肽(PⅢP)水平明顯降低,白蛋白水平顯著增高.提示我們雙環(huán)醇可能通過下調HSC內NF-κB的基因表達,從而使HSC的凋亡增加,減緩肝纖維化的進程。本文的主要目的是研究雙環(huán)醇對實驗性HSC是否具有抗凋亡作用,從而為擴大雙環(huán)醇臨床應用提供理論依據。 目的:本實驗通過設計用不同濃度的雙環(huán)醇對體外培養(yǎng)的肝星狀細胞的作用,研究其對腫瘤壞死因子-a(TNF-a)激活的肝星狀細胞增殖與凋亡的影響。 方法:體外培養(yǎng)大鼠肝星狀細胞,進行以下分組:按下列分組進行處理:①對照組;②TNFá組;③雙環(huán)醇組④TNF-a+雙環(huán)醇。 應用電泳遷移率改變實驗(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)測定NF-κB活性變化;免疫熒光染色法(抗大鼠Cy3)測定NF-κB在HSCs中的分布;反轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)檢測基質金屬蛋白酶抑制因子-1(Timp-1)的mRNA的表達;MTT方法測定HSCs增殖率;末段脫氧核苷酸轉移酶介導的脫氧三磷酸尿苷缺口末段標記法(terminal deoxynucleotidy1 transferase-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)檢測細胞凋亡的變化。 結果: 1.EMSA顯示對照組即可檢測出較高的NF-κB結合活性,TNF-a刺激后,NF-κB結合活性升高明顯(P0.01);雙環(huán)醇干預后,雙環(huán)醇組的NF-κB結合活性明顯下降(P0.01);TNF-a +雙環(huán)醇組亦可檢測出較高的NF-κB結合活性,與TNF-a組比較無明顯減低,(P0.05). 2.免疫細胞熒光染色法顯示:對照組及TNF-a組NF-κB陽性細胞較多,細胞形態(tài)正常,且在熒光顯微鏡下可以觀察到紅色的熒光,TNF-a組觀察到紅色的熒光強度高于對照組;雙環(huán)醇組陽性細胞減少,并出現濃染致密的凋亡細胞。 3.反轉錄聚合酶鏈反應顯示:0.5mmol/L雙環(huán)醇組的HSC Timp1的mRNA表達減低,較TNF-a組顯著減低(P0.01),與對照組及TNF-a +雙環(huán)醇組比較均減低,表明經0.5mmol·L-雙環(huán)醇干預后Timp1的mRNA表達減低。 4.MTT方法測定顯示,與對照組相比TNF-a組在24h,48h和72h都有明顯差異,雙環(huán)醇組在48h(P0.05)有明顯差異。與TNF-a組相比雙環(huán)醇組在24h,48h和72h都有明顯差異,TNF-a和雙環(huán)醇合用組在24h,48h和72h亦有明顯差異。 5.雙環(huán)醇作用后的TNF-a激活的HSC凋亡增加:TUNEL法結果顯示24h,48h,72h三組0.5mmol·L雙環(huán)醇組細胞凋亡較TNF-a組增加(P0.01),而48h,72h兩組之間的凋亡率無明顯差異(P0.05)。 結論: 1.體外細胞培養(yǎng)研究表明,TNF-a可以刺激HSCs增殖并促進NF-κB蛋白含量及結合活性的表達;雙環(huán)醇對NF-κB蛋白表達和結合活性有抑制作用。 2.雙環(huán)醇可以抑制TNF-a刺激的HSCs增殖并誘導其凋亡。 3 .雙環(huán)醇可促進HSC的凋亡,同時Timp1合成減少,有利于抗肝纖維化作用。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R575.2

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本文編號：2727902