【摘要】：治療終末期肝病所致的肝功能衰竭是臨床治療的一大難題,目前除了改善臨床癥狀外沒(méi)有較為有效的治療手段,尤其是無(wú)法再生損傷、死亡的肝臟細(xì)胞,這使得肝移植可能成為目前一種可恢復(fù)肝臟功能的治療方法,然而因其供體短缺、免疫排斥、治療費(fèi)用較高等原因,臨床應(yīng)用難以推廣。現(xiàn)在隨著細(xì)胞生物技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,以及對(duì)干細(xì)胞研究的深入,通過(guò)干細(xì)胞移植治療慢性肝病越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外專(zhuān)家的重視。干細(xì)胞是一類(lèi)具有無(wú)限自我增殖更新能力的多潛能細(xì)胞,在特定的條件下具有定向誘導(dǎo)分化的潛能,如在特定的條件下,干細(xì)胞能夠向內(nèi)胚層的肝臟細(xì)胞分化。因此,干細(xì)胞再生技術(shù)為肝病的治療提供了一種新的研究方向。 目的:本課題組已在前期研究工作中證明大鼠周?chē)杉?xì)胞在一定條件下可以誘導(dǎo)分化為肝樣細(xì)胞。此次本實(shí)驗(yàn)研究經(jīng)rhG-CSF動(dòng)員后肝硬化患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)中CD34+細(xì)胞的含量,以及PBMCs在HGF、FGF-4誘導(dǎo)因子的作用下能否向肝臟樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化,證實(shí)外周血干細(xì)胞的可塑性,進(jìn)一步為臨床上探索外周血干細(xì)胞移植治療肝病提供理論依據(jù)。 方法: 1.用血細(xì)胞分離機(jī)采集經(jīng)G-CSF動(dòng)員后肝硬化患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞,并通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34的含量。 2.密度梯度離心法分離純化單個(gè)核細(xì)胞。用RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)外周血單個(gè)核細(xì)胞,并洗滌未貼壁細(xì)胞,進(jìn)一步出去雜細(xì)胞,使之純化。 3.用含10%胎牛血清、M-CSF、IL-3、β-巰基乙醇的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)貼壁細(xì)胞6天,每2天換液1次。 4. 6天后半量換液,加入含有10%胎牛血清、HGF、FGF-4的RPMI1640培養(yǎng)液對(duì)貼壁細(xì)胞誘導(dǎo),每2天半量換液1次并繼續(xù)培養(yǎng)到第20天。 5.在培養(yǎng)過(guò)程中觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化,免疫熒光法檢測(cè)第6、14、20天肝細(xì)胞標(biāo)志物AFP、CK18的表達(dá)情況。 6.對(duì)于誘導(dǎo)后7天、14天細(xì)胞Western Blot檢測(cè)肝細(xì)胞特異性表達(dá)。 結(jié)果: 1.血細(xì)胞分離機(jī)分離出的外周血中單個(gè)核細(xì)胞數(shù)≥109/kg,CD34+含量為0.4%。 2.分離出的細(xì)胞呈圓形,臺(tái)盼蘭染色檢測(cè)細(xì)胞活率95%,培養(yǎng)2小時(shí)后,培養(yǎng)液洗滌去除未貼壁細(xì)胞,貼壁細(xì)胞呈現(xiàn)小圓形,大小均勻,透明度大。 3.在M-CSF、IL-3培養(yǎng)基中培養(yǎng)貼壁細(xì)胞6天后,可觀察到細(xì)胞呈圓形,集落成群生長(zhǎng),細(xì)胞趨向融合。在未給予增殖因子的對(duì)照組中,細(xì)胞大部分呈現(xiàn)梭形伸展,單個(gè)生長(zhǎng)。 4.經(jīng)HGF、FGF-4誘導(dǎo)7天后,可見(jiàn)細(xì)胞一部分呈現(xiàn)多邊形,體積變大;誘導(dǎo)14天后,細(xì)胞總體數(shù)量減少,多邊形細(xì)胞比例增多。未加誘導(dǎo)因子的對(duì)照組,細(xì)胞呈梭形生長(zhǎng),大部分細(xì)胞貼壁伸展。 5.對(duì)誘導(dǎo)后第14、20天的細(xì)胞用免疫熒光法檢測(cè)AFP、CK18的表達(dá),熒光顯微鏡下顯示結(jié)果均為陽(yáng)性。對(duì)照組以及加入誘導(dǎo)因子前AFP和CK18的表達(dá)為陰性。 6.誘導(dǎo)7天、14天的細(xì)胞經(jīng)Western Blot檢測(cè)到肝細(xì)胞特異性表達(dá)。 結(jié)論:外周血單個(gè)核細(xì)胞在一定的條件下具有向肝臟樣細(xì)胞分化的潛能,并可能代替骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療肝病。 1.動(dòng)員后肝硬化患者外周血單個(gè)核細(xì)胞,體外在一定誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下可轉(zhuǎn)分化為肝樣細(xì)胞。 2.轉(zhuǎn)分化的肝樣細(xì)胞可有AFP、ALB、CK-18的表達(dá),其中,ALB、CK-18表達(dá)強(qiáng)度與培養(yǎng)時(shí)間成正比,而AFP成反比。 3.未進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)的單個(gè)核細(xì)胞很少轉(zhuǎn)分化為肝樣細(xì)胞。 4.外周血單個(gè)核細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為有肝細(xì)胞功能的同時(shí),有細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變,近似于肝細(xì)胞。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R575.3
【圖文】：

（二）B 組未加任何增殖誘導(dǎo)因子培養(yǎng)：新鮮分離的外周血單個(gè)核細(xì)胞為透形，大小均一，折光性較強(qiáng)，臺(tái)盼蘭染色測(cè)定活細(xì)胞率>95%，培養(yǎng) 4-6 小時(shí)上清，棄去未貼壁細(xì)胞后可見(jiàn)貼壁細(xì)胞，呈圓形、類(lèi)圓形。培養(yǎng) 7 天后細(xì)胞個(gè)生長(zhǎng)未見(jiàn)集落，部分細(xì)胞逐漸伸展呈梭形生長(zhǎng)。14 天后細(xì)胞大部分呈纖維樣部分仍類(lèi)圓形。見(jiàn)圖 3。圖 3：新鮮分離的 PBMCs 圖 3：培養(yǎng)第 7 天的 PBMCs倒置相差顯微鏡（x10） 倒置相差顯微鏡（x10）

圖 2：L02 肝臟細(xì)胞倒置相差顯微鏡（x20）（二）B 組未加任何增殖誘導(dǎo)因子培養(yǎng)：新鮮分離的外周血單個(gè)核細(xì)胞為透形，大小均一，折光性較強(qiáng)，臺(tái)盼蘭染色測(cè)定活細(xì)胞率>95%，培養(yǎng) 4-6 小時(shí)上清，棄去未貼壁細(xì)胞后可見(jiàn)貼壁細(xì)胞，呈圓形、類(lèi)圓形。培養(yǎng) 7 天后細(xì)胞個(gè)生長(zhǎng)未見(jiàn)集落，部分細(xì)胞逐漸伸展呈梭形生長(zhǎng)。14 天后細(xì)胞大部分呈纖維樣部分仍類(lèi)圓形。見(jiàn)圖 3。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2726635