【摘要】：鐵是生物體內(nèi)重要的微量元素，參與細(xì)胞內(nèi)多種氧化還原反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長分化。但是鐵在體內(nèi)的大量聚積，可以誘導(dǎo)機體內(nèi)活性氧水平的上升，引起生物大分子（蛋白質(zhì)、DNA和脂質(zhì)）的氧化，最終對機體造成損傷。在酒精性肝病發(fā)生的過程中，鐵有重要的作用。酒精性肝病患者的肝組織中通常存在大量鐵的聚集。雖然現(xiàn)在已經(jīng)有動物研究表明鐵對酒精引起得肝臟損傷具有正協(xié)同的作用，但是還沒有在細(xì)胞水平研究鐵對酒精誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的影響。黃酮類化合物是廣泛存在于植物中的多酚類物質(zhì)，也是多種具有益生作用植物的有效成分。大量的動物實驗證明，很多黃酮類化合物對于慢性或急性酒精刺激誘導(dǎo)的肝損傷，具有一定的治療或預(yù)防效果。但是沒有構(gòu)建出合適的鐵-酒精肝細(xì)胞損傷模型用于篩選治療或預(yù)防酒精性肝損傷的黃酮類化合物。 本文從細(xì)胞水平實驗入手，首先分析了不同形態(tài)的鐵的催化氧化能力與肝細(xì)胞損傷之間的關(guān)系；然后利用從中篩選的檸檬酸鐵作為外源鐵添加劑，在HepG2細(xì)胞（在該細(xì)胞系中CYP2E1不表達）中，研究了鐵的催化氧化的作用對酒精誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的影響，以及黃酮類化合物保護作用的機理。主要結(jié)果如下： （1）不同形態(tài)的鐵催化氧化的能力與肝細(xì)胞損傷之間的關(guān)系。 首先，在體外化學(xué)體系上研究了高鐵血紅蛋白以及三種非蛋白結(jié)合小分子鐵化合物——氯高鐵原卟啉、檸檬酸鐵和EDTA-Fe（III）——催化氧化的能力。再以人肝癌細(xì)胞系HepG2為研究對象，采用MTT法檢測細(xì)胞活性，Annexin V/PI雙染法流式檢測細(xì)胞凋亡，免疫熒光的方法檢測細(xì)胞蛋白質(zhì)硝基修飾的情況和4-HNE的水平，免疫沉淀和蛋白質(zhì)印跡的方法檢測α-烯醇酶的表達和硝化。結(jié)果顯示：在體外化學(xué)體系中，氯高鐵原卟啉和高鐵血紅蛋白具有較強的催化氧化的能力，檸檬酸鐵基本上沒有催化氧化的能力，EDTA-Fe（III）催化氧化的能力相對較弱；在細(xì)胞水平上，氯高鐵原卟啉和EDTA-Fe（III）可以促進葡糖糖氧化酶（GO）/葡糖糖（G）-NaNO2體系誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的程度，氯高鐵原卟啉鐵的作用要明顯高于EDTA-Fe（III），檸檬酸鐵和高鐵血紅蛋白構(gòu)建的Fe（III）-GO/G-NaNO2體系不能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；不同鐵構(gòu)成的Fe（III）-GO/G-NaNO2對于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的表達和硝化、脂質(zhì)過氧化的影響不同。這表明：在體外化學(xué)體系中，含鐵化合物催化氧化的作用，主要依賴卟啉鐵的參與；在細(xì)胞體系中，含鐵化合物對肝細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達或硝化、脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞凋亡的影響和它自身催化氧化的能力沒有直接的關(guān)系。 （2）檸檬酸鐵促進酒精誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激及黃芩苷的作用。 以HepG2細(xì)胞（在該細(xì)胞系中CYP2E1不表達）為研究對象，采用MTT法檢測細(xì)胞活性、Annexin V/PI雙染法流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡、免疫熒光的方法檢測細(xì)胞iNOS表達、蛋白質(zhì)酪氨酸硝化和4-HNE的水平、蛋白質(zhì)印跡的方法檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)羰基化程度和ERK1/2磷酸化的程度、用DCFH和DMA-DA熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)ROS和NO的水平，研究了鐵對酒精誘導(dǎo)的氧化/硝化應(yīng)激的影響以及黃芩苷的作用。結(jié)果表明：鐵對酒精誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS、NO、蛋白質(zhì)羰基化、蛋白質(zhì)酪氨酸硝化和脂質(zhì)過氧化水平的上升具有促進的作用；鐵和酒精的共同作用還可以改變iNOS在細(xì)胞的分布；鐵增加了酒精誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的程度；在酒精-鐵模型中，抑制iNOS的活性可以增加細(xì)胞死亡的數(shù)量；鐵和酒精可以增加ERK1/2的磷酸化水平，酒精抑制了ERK1/2磷酸化的水平；黃芩苷可以通過降低細(xì)胞內(nèi)ROS、NO、蛋白質(zhì)羰基化、蛋白質(zhì)酪氨酸硝化和脂質(zhì)過氧化的水平，阻斷鐵和酒精引起的iNOS在細(xì)胞內(nèi)分布的變化，減低ERK1/2磷酸化的程度，從而減少了細(xì)胞凋亡的程度；iNOS活性的抑制可以增強鐵和酒精誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的程度。這說明：雖然在酒精誘導(dǎo)肝細(xì)胞內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激的過程中CYP2E1發(fā)揮了重要的作用，但是在CYP2E1不表達的肝細(xì)胞中外源鐵可以促進酒精誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激；參與調(diào)控酒精和鐵誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的細(xì)胞內(nèi)信號通路是不一樣的；在鐵-酒精細(xì)胞模型中，NO可能是一種信號分子，具有保護細(xì)胞的作用。 （3）研究鐵-酒精肝細(xì)胞損傷模型中黃酮類化合物護肝作用的機理 采用MTT法檢測細(xì)胞活性，ABTS法檢測黃酮類化合物的抗氧化作用，并利用PI單染活細(xì)胞檢測檢測死亡細(xì)胞的數(shù)目，最后利用熒光顯微鏡檢測細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子的水平，綜合研究了在鐵-酒精肝細(xì)胞損傷模型中，黃酮類物質(zhì)保護肝細(xì)胞的作用與它的抗氧化性和鐵結(jié)合能力之間的關(guān)系。結(jié)果表明：在鐵-酒精肝細(xì)胞損傷模型中黃酮類化合物的保護作用主要和它的鐵結(jié)合能力有關(guān)，但并不是具有鐵結(jié)合能力的黃酮類化合物都會在這個細(xì)胞模型中發(fā)揮保護肝細(xì)胞的作用；利用超氧陰離子探針可以在熒光顯微鏡下直接觀察到酒精、鐵、黃酮類物質(zhì)對于細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的影響，這克服了一些黃酮類化合物由于具有胰蛋白酶的抑制效果而造成的研究方法選擇上的障礙；本文中構(gòu)建的鐵-酒精肝細(xì)胞損傷模型不僅可以用來篩選具有護肝作用的單一黃酮類化合物，也可以用來分析天然提取物在鐵-酒精誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷中的作用。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R575
【圖文】：

圖 1.1 四種黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)式Figure 1.1 The molecular structure of each group of flavonoids.生理作用1 抗氧化作用對大多數(shù)的黃酮類物質(zhì)都具有抗氧化的作用。其中，黃酮類和兒茶酚類是免除自由基損傷效果最好的黃酮類物質(zhì)。機體受到外源性損傷或者氧化代謝時，可以產(chǎn)生自由基和活性氧，這些物組織細(xì)胞造成持續(xù)的危害。雖然，目前的研究還不能對于自由基干擾細(xì)胞體機制給出全面的解釋，但是脂質(zhì)過氧化以及由脂質(zhì)過氧化引起的細(xì)胞膜為在其中發(fā)揮著重要的作用。細(xì)胞膜損傷改變了細(xì)胞的凈電荷和滲透壓，細(xì)胞的膨脹，最終導(dǎo)致細(xì)胞壞死。自由基可以引起多種炎癥調(diào)節(jié)因子的產(chǎn)生發(fā)炎癥反應(yīng)和組織損傷。

催化氧化能力的差別。利用亞甲基藍的方法，測定不同類型的鐵催化氧化產(chǎn)生的羥自由基的能力（圖2.1）。含有氯高鐵原卟啉（H）和高鐵血紅蛋白（Mb）具有較強的催化氧化的能力，檸檬酸鐵（Fc）基本上沒有催化氧化的能力，EDTA-Fe（EF）的催化氧化能力相對較弱。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 陳小夏,何冰;茶多酚清除氧自由基與抗脂質(zhì)過氧化作用[J];中藥材;1998年03期

本文編號：2723815