【摘要】：食管下括約肌(Lower esophageal sphincter, LES)是位于食管胃結合部的約2-3厘米的特殊的增厚的環(huán)形肌束。1979年，Liebermann-Meffert首次提出了人食管下括約肌是由位于胃大彎側斜行的套索纖維（sling fibers）與胃小彎側的半環(huán)形的鉤狀纖維(clasp fibres)共同構成。鉤狀纖維，套索纖維與膈腳一起，在神經，體液等多種因素調解下，保持持續(xù)收縮狀態(tài)，從而在食管胃交接部形成高壓帶，構成人體內生理性抗返流屏障，防止胃內容物的返流。 食管下括約肌收縮和舒張的調節(jié)機制是在中樞神經系統(tǒng)的支配下，由多種神經遞質、激素和自身肌源性因素共同參與完成的。迷走神經的輸出神經末梢和食管下括約肌的腸道運動神經元共同構成了抑制性和興奮性運動傳導通路。興奮性運動傳導通路由節(jié)前膽堿能運動神經元與節(jié)后膽堿能運動神經元共同構成。抑制性運動神經元由節(jié)前膽堿能運動神經元與節(jié)后非膽堿能非腎上腺素能神經元共同構成。興奮性或抑制性神經通路的激活導致膽堿能節(jié)后神經元或腸道神經元多種神經遞質的釋放，正是通過這些釋放的神經遞質來實現(xiàn)對食管下括約肌收縮或舒張的調節(jié)。目前比較明確的是興奮性神經傳導通路的激活可以釋放乙酰膽堿和P物質，從而引起食管下括約肌的收縮。抑制性傳導通路的激活，引起腸道神經元釋放一氧化氮和血管活性腸肽等神經遞質，導致食管下括約肌的舒張。 研究表明，食管運動障礙性疾病如彌漫性食管痙攣、賁門失弛緩癥以及胡桃夾食管等疾病中均表現(xiàn)有食管下括約肌的異常。因此，對于食管下括約肌調節(jié)機制的研究對食管運動障礙性疾病的診斷與治療有及其重要的意義。目前國內外對于食管下括約肌的研究主要集中在一氧化氮，乙酰膽堿，血管活性腸肽以及P物質等神經遞質，受體以及信號傳導通路。 腎上腺素β受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，廣泛分布于哺乳動物的中樞及外周神經系統(tǒng)，并發(fā)揮著極其重要的作用。腎上腺素β受體有β_1、β_2和β_3受體三種亞型。研究表明，腎上腺素β受體廣泛地分布于動物的胃腸道之中。 本實驗擬采用蛋白印跡法（Western-blot），逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)，電場刺激（Electrical field stimulation, EFS）以及離體肌張力測定技術等方法，對腎上腺素β受體在人食管下括約肌的表達及功能進行研究，探討人腎上腺素β受體在人食管下括約肌調節(jié)機制中的作用，為進一步完善人食管下括約肌的調節(jié)機制，治療食管運動障礙性疾病提供理論依據(jù)。 第一部分腎上腺素β受體在人食管下括約肌的表達規(guī)律 目的：腎上腺素β受體是G蛋白偶聯(lián)受體家族重要的受體之一。本實驗采用蛋白印跡法（Western-blot），逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)研究人食管下括約肌中的腎上腺素β受體三種亞型在套索纖維、鉤狀纖維、食管和胃底環(huán)形肌中的表達規(guī)律。 方法：選取河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院自2011年1月到2011年10月因食管中段癌行食管大部切除術患者30例，其中男性患者24例，女性患者6例，平均年齡62歲。在手術室收集新鮮食管胃結合部標本，制備套索纖維、鉤狀纖維、胃底和食管環(huán)形肌肌條。提取組織總RNA，分別應用三種腎上腺素亞型的引物行RT-PCR，用Gel Pro軟件分析擴增產物的光密度值(IOD)，用腎上腺素β亞型與β-actin的IOD的比值來表示肌條中mRNA的相對含量。提取組織總蛋白，將蛋白調整至相同濃度，電泳分離出腎上腺素β受體的各個亞型后轉膜，再分別應用腎上腺素β受體的各個亞型抗體進行孵育，經Gel Pro軟件分析各反應條帶的光密度值（IOD）。 結果：紫外分光度計測定顯示，總RNAA260/A280比值為1.8-2.0。三種β受體亞型的mRNA在各肌條均有表達：分別是β_1-AR, β_2-AR, β3-AR。β_3-AR表達量最高，它在索纖維、鉤狀纖維、食管平滑肌和胃底平滑肌表達水平分別為1.442±0.056；1.451±0.041；1.471±0.027；1.432±0.054；β_1-AR表達水平次之，依次為1.129±0.044；1.137±0.049；1.126±0.043；1.120±0.053；β_2-AR表達量最低，依次為0.469±0.038；0.465±0.032；0.469±0.042；0.460±0.060；在同一種肌條中，三種受體亞型的表達量有統(tǒng)計學差異(F=4100, P=0.00).。同一種受體亞型，在各肌條間mRNA的表達無差異(F=0.78, P=0.30)。同一種受體亞型，在各肌條間mRNA的表達無差異(F=0.78, P=0.30)。三種β受體受體亞型均有其相應蛋白條帶的表達：分別是β_1-AR, β_2-AR, β_3-AR。β_3-AR表達量最高，它在套索纖維、鉤狀纖維、食管平滑肌和胃底平滑肌表達水平分別為0.526±0.017；0.510±0.013；0.524±0.014；0.535±0.016；β_1-AR表達水平次之，依次為0.399±0.014；0.386±0.019；0.383±0.017；0.386±0.024；β_2-AR表達量最低，依次為0.162±0.132；0.151±0.014；0.164±0.016；0.152±0.016；在同一種肌條中，三種受體亞型的表達量有統(tǒng)計學差異（F=39, P=0.00）。同一種受體亞型，在各肌條間蛋白的表達無差異（F=0.30, P=0.54） 結論：人LES中存在著三中腎上腺素β亞型，分別是腎上腺素β1-AR，β_2-AR，β_3-AR。其表達水平依次是β_3-ARβ_1-AR β_2-AR�？赡茉谌薒ES的功能調解中發(fā)揮著作用。 第二部分腎上腺素β受體在人食管下括約肌調節(jié)機制的作用 目的：研究非選擇性的腎上腺素β受體激動劑和拮抗劑以及選擇性的腎上腺素β受體激動劑和拮抗劑對人離體LES肌條的作用，探討腎上腺素β受體在人LES收縮和舒張調節(jié)機制中的作用。 方法：選取2011年10月至2012年3月在河北醫(yī)科大學第四附屬醫(yī)院胸三科因食管中段癌行食管大部分切除的患者共30例，其中男性20例，女性10例，平均年齡63歲。在手術室采取新鮮食管胃結合部標本立即放入4℃Krebs中，沖洗干凈的標本粘膜面向上固定在盛有Krebs液體的蠟盤中，并持續(xù)通有含5％CO和95％O_2的氣體。沿胃大彎側切開標本，銳性剝離賁門部及食管下段的粘膜層及粘膜下層，發(fā)現(xiàn)位于食管胃交界處的發(fā)白增厚的肌環(huán)即為食管下括約肌，肉眼識別出套索纖維與鉤狀纖維。套索纖維位于標本的兩端并呈斜行分布，而鉤狀纖維則位于標本的中央。游離鉤狀纖維和套索纖維，制備成(2~4) mm×(8~12) mm的肌條。 用絲線扎緊肌條兩端，置于含Krebs液37℃恒溫的10毫升浴槽中，并持續(xù)通以含5％CO和95％O_2的氣體。肌條上端與JZ101型肌肉張力換能器固定，經由Medlab信號采集器記錄肌條的張力變化情況。緩慢牽拉肌條使之張力穩(wěn)定于200mg，此時的肌條長度即為初始長度L0.然后多次緩慢牽拉肌條，每次增加長度約為初始長度的25％左右，直至肌條長度拉伸至初長度的200％作為最適初長度。 待肌條最適初長度穩(wěn)定約30分鐘后，然后以濃度累計方式分別向恒溫浴槽中加入非選擇性的腎上腺素β受體激動劑以激活各受體亞型。給藥濃度為(10~(-9)、10~(-8)、10~(-7)、10~(-6)、10~(-5)、10~(-4)、10~(-3)mol/L)。觀察給藥后肌條張力的變化情況，待張力穩(wěn)定后再增加一個濃度，每次加藥前都要等前一濃度達到最大反應且穩(wěn)定后再加入下一濃度藥物。每次加藥與前一濃度穩(wěn)定的時間間隔為10分鐘。據(jù)此繪制累計給藥的濃度-反應量效曲線。觀察拮抗劑效應時，在加入激動劑前30分鐘，加入拮抗劑，拮抗劑的濃度與激動劑誘導肌條產生最大效應的激動劑濃度相同。選擇性的β-AR受體激動劑，選擇性的β-AR拮抗劑的加藥方法同前。藥物誘發(fā)的肌條反應以肌條收縮或舒張的百分比的均數(shù)±標準誤(x±SE)來表示。 結果 1非選擇性腎上腺素β受體激動劑異丙腎上腺素在10-4mol/L的濃度可以誘導人食管下括約肌肌條產生舒張效應。應用非選擇性的腎上腺素β受體阻滯劑心得安對異丙腎上腺素產生的舒張作用無效。但此作用可以被選擇性腎上腺素β_3受體選擇性拮抗劑L748337所阻斷。 2選擇性的腎上腺素β_1受體激動劑多巴酚丁胺和β_2受體激動劑沙丁胺醇對食管下括約肌肌條均沒有作用。選擇性的腎上腺素β_3受體激動劑BRL37344在（10~(-9)、10~(-8)、10~(-7)、10~(-6)、10~(-5)、10~(-4)mol/L）濃度下可以誘導人食管下括約肌肌條產生濃度依賴性的舒張效應，在10-4mol/L時，肌條均達到最大收縮百分比，為（（80.4±0.6））％。應用選擇性的腎上腺素β_3受體拮抗劑L748337后，BRL37344誘導肌條產生收縮的能力明顯下降，肌條均達到最大收縮百分比，為（54.6±0.5）％。應用拮抗劑前后兩肌條間收縮效應比較有統(tǒng)計學差異（P0.05）。 結論： 1非選擇性腎上腺素β受體激動劑異丙腎上腺素在10-4mol/L的濃度可以誘導人食管下括約肌肌條產生舒張效應。應用非選擇性的腎上腺素β受體阻滯劑心得安對異丙腎上腺素產生的舒張作用無效。但此作用可以被腎上腺素β_3受體選擇性拮抗劑L748337所阻斷。提示腎上腺素β_1和β_2受體可能沒有參與對人食管下括約肌的調節(jié)作用，腎上腺素β_3可能參與了對人食管下括約肌的調節(jié)。 2選擇性的腎上腺素β_1受體激動劑多巴酚丁胺和β_2受體激動劑沙丁胺醇對離體食管下括約肌肌條無作用。選擇性的腎上腺素β_3受體激動劑可以誘導人食管下括約肌肌條產生濃度依賴性的舒張效應，選擇性的腎上腺素β_3受體拮抗劑L748337可阻斷BRL37344的作用。進一步提示腎上腺素β_1和β_2受體可能沒有參與對人食管下括約肌的調節(jié)作用，腎上腺素β_3可能參與了對人食管下括約肌的調節(jié)。 第三部分腎上腺素β受體在電場刺激引起的人食管下括約肌反應中的作用 目的：研究選擇性腎上腺素β受體拮抗劑在電場刺激下對人食管下括約肌的作用，探討腎上腺素β受體在人食管下括約肌舒張調節(jié)中的作用。 方法：選取2012年3月到2012年12月在河北醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院胸三科因食管中上段癌，行食管大部分切除的患者30例，其中男性25例，女性5例，平均年齡60歲。食管下括約肌肌條的制備方法同前。將肌條置于37℃恒溫含Krebs液的10毫升浴槽中，并持續(xù)通以含5％CO_2和95％O_2的氣體。肌條的上端與肌肉張力換能器相連，下端固定于帶有鉑金電極的L形固定架上，利用Medlab信號采集器記錄肌條的張力變化情況。肌肉張力信號經Medlab信號采集系統(tǒng)采集。牽拉肌肉至最適初長度方法同前。然后在持續(xù)通以含有5%CO_2和95%O_2的混合氣體的Krebs液中再次溫浴1小時。 EFS刺激參數(shù)：單脈沖方波，波寬5ms，電壓50V,頻率1-512Hz以倍數(shù)遞增。加入阿托品后，按頻率從小到大行EFS,計算刺激后產生的最大效應。刺激停止后待肌條回復平衡后，分別加入河豚毒素,選擇性的腎上腺素β_1受體拮抗劑Nebivolol,選擇性的β_2受體拮抗劑ICI118551和選擇性的β_3受體拮抗劑L-748337，在加藥20分鐘后再給予EFS。EFS誘發(fā)的肌條反應均以肌條的收縮或舒張百分比的均數(shù)±標準誤(x±SE)來表示。 結果： 1EFS可以誘導食管下括約�。ㄣ^狀纖維和套索纖維），產生頻率依賴性舒張反應，最大舒張電刺激頻率為64HZ。EFS誘導食管下括約肌舒張的最大舒張百分比為（22.1±0.4）％。 2河豚毒素能明顯降低EFS引起的人食管下括約肌頻率依賴性舒張比較用藥前后肌條的舒張效應有統(tǒng)計學差異（P0.05）。 3EFS誘導產生的人食管下括約肌頻率依賴性舒張反應，選擇性β_1受體拮抗劑Nebivolol（P0.05）和選擇性的β_2受體拮抗劑ICI118551（P0.05）對其無抑制效應，比較用藥前后舒張效應無統(tǒng)計學意義。選擇性的β_3受體拮抗劑L-748337對EFS引起的人食管下括約肌產生的頻率依賴性舒張反應有抑制作用，用藥前后舒張反應有統(tǒng)計學差異（P0.05）。 結論： 1河豚毒素能明顯降低EFS引起的人食管下括約肌頻率依賴性舒張。比較用藥前后肌條的舒張效應有統(tǒng)計學差異。提示EFS誘導產生的人食管下括約肌頻率依賴性舒張是神經來源的。 2EFS誘導產生的人食管下括約肌頻率依賴性舒張反應，選擇性的腎上腺素β_1受體拮抗劑Nebivolol和選擇性的β_2受體拮抗劑ICI118551對其無舒張效應，比較用藥前后舒張效應無統(tǒng)計學意義。選擇性的β_3受體拮抗劑L-748337對EFS引起的人食管下括約肌產生的頻率依賴性舒張反應有抑制作用，用藥前后舒張反應有統(tǒng)計學差異。提示EFS誘導產生的人食管下括約肌頻率依賴性舒張可能有腎上腺素β_3受體的參與，可能沒有腎上腺素β_1受體和β_2受體的參與。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R57

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本文編號：2719048