【摘要】： 目的 通過檢測慢加急性肝衰竭患者外周血單個核細(xì)胞中腫瘤壞死因子-α的甲基化狀態(tài)與蛋白表達(dá)水平的關(guān)系,探討腫瘤壞死因子-α及表觀遺傳調(diào)控在慢加急性肝衰竭發(fā)病機(jī)制中的可能作用。 方法 1、研究對象 慢加急性肝衰竭患者組20例,慢性乙型病毒性肝炎患者組12例,為2009年3月-2009年12月山東大學(xué)齊魯醫(yī)院肝病科住院和門診患者,均符合2000年(西安)第十次全國傳染病寄生蟲病學(xué)術(shù)會議修訂的“病毒性肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)”。健康對照組12例。 2、研究方法 ELISA法檢測外周血腫瘤壞死因子α(TNF-α)的表達(dá),并與患者的肝功能進(jìn)行相關(guān)性分析,主要檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、血清總膽紅素(TBIL)水平、凝血酶原活動度(PTA)、血清乙型肝炎病毒定量、終末期肝臟病模型(MELD)評分。觀察慢加急性肝衰竭患者不同病情程度血清TNF-α表達(dá)的變化,初步探討TNF-α在慢加急性肝衰竭發(fā)病機(jī)制中的作用。 提取外周血單個核細(xì)胞DNA,重亞硫酸鹽處理后,用針對改變后的DNA序列設(shè)計特異性引物并進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。PCR產(chǎn)物中原先非甲基化的胞嘧啶位點被胸腺嘧啶所替代,而甲基化的胞嘧啶位點保持不變。根據(jù)修飾后DNA序列的不同,運用在線MethPrimer軟件設(shè)計引物,甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(methylation specific polymerase chain reaction,MSP)檢測標(biāo)本中TNF-α擴(kuò)增產(chǎn)物,如果用引物M能擴(kuò)增出片段,則說明檢測位點存在甲基化；若用引物U擴(kuò)增出片段,則說明被檢測的位點不存在甲基化。分析TNF-α啟動子甲基化與血清TNF-α表達(dá)的相關(guān)性,并分析甲基化與病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性,探討DNA甲基化在慢加急性肝衰竭發(fā)病機(jī)制中的作用。 3、統(tǒng)計學(xué)分析： 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示。用t檢驗進(jìn)行兩組間比較,方差分析行多組間比較,率差異行卡方檢驗,Spearman等級相關(guān)分析進(jìn)行兩因素相關(guān)性檢驗,均以P0.05為有顯著性差異。 結(jié)果 1.外周血清TNF-α表達(dá)：慢加急性肝衰竭患者組外周血TNF-α蛋白水平均高于慢性乙型病毒性肝炎患者組和健康對照組,且各組間比較均具有顯著性差異(P0.05) 2.慢加急性肝衰竭患者組外周血清TNF-α水平與血清ALT關(guān)系：統(tǒng)計結(jié)果顯示外周血清TNF-α水平與血清ALT無明顯相關(guān)性(r=-0.185,P=0.435)。 3.慢加急性肝衰竭患者組外周血清TNF-α水平與血清TBIL關(guān)系：統(tǒng)計結(jié)果顯示外周血清TNF-α水平與血清TBIL呈明顯的正相關(guān)(r=0.891,P0.01),TBIL較高的患者外周血清TNF-α水平明顯高于TBIL較低的患者。 4.慢加急性肝衰竭患者組外周血清TNF-α水平與PTA關(guān)系：統(tǒng)計結(jié)果顯示外周血清TNF-α水平與PTA呈明顯的負(fù)相關(guān)(r=-0.511,P=0.021),PTA越低的患者外周血清TNF-α水平明顯高于PTA高的患者。 5、慢加急性肝衰竭患者組外周血清TNF-α水平與血清HBV-DNA的關(guān)系：統(tǒng)計結(jié)果顯示外周血清TNF-α水平與血清HBV-DNA之間無顯著的相關(guān)性(r=-0.026,P=0.912)。 6、慢加急性肝衰竭患者組外周血清TNF-α水平與終末期肝臟病模型(MELD)評分之間的關(guān)系：統(tǒng)計結(jié)果顯示外周血清TNF-α水平與終末期肝臟病模型(MELD)評分之間呈明顯的正相關(guān)(r=0.792,P0.01)。 7、慢加急性肝衰竭患者組TNF-α啟動子完全甲基化率為15%(3／20),未甲基化率為85%(17／20)。慢性乙型病毒性肝炎患者組完全甲基化率為50%(6／12),未甲基化率為50%(6／12)。健康對照組完全甲基化率為66.7%(8／12),未甲基化率為33.3%(4／12)。慢加急性肝衰竭組、慢性乙型病毒性肝炎患者組、健康對照組TNF-α啟動子甲基化狀態(tài)的差別有統(tǒng)計學(xué)意義。(x2=9.343,df=2,P=0.009)。 8、慢加急性肝衰竭患者甲基化組與非甲基化組血清TNF-α水平比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,慢加急性肝衰竭患者甲基化組血清TNF-α水平明顯低于非甲基化組(P0.05)。慢性乙型病毒性肝炎患者甲基化組與非甲基化組血清TNF-α水平比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,慢性乙型病毒性肝炎患者甲基化組血清TNF-α水平明顯低于非甲基化組(P0.05)。健康對照甲基化組與非甲基化組血清TNF-α水平比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,健康對照甲基化組血清TNF-α水平明顯低于非甲基化組(P0.05)。 結(jié)論 1.在慢加急性肝衰竭患者中,血清ALT水平高低已不能反映病情嚴(yán)重程度,而血清TBIL及PTA才是反映肝臟功能的常用指標(biāo),前者水平越高,后者水平越低,反映肝臟功能越差。在慢加急性肝衰竭中,通過TNF-α與TBiL和PTA之間關(guān)系的比較,發(fā)現(xiàn)TBil較高的患者其TNF-α水平也高,提示TNF-α可能與肝炎活動與肝細(xì)胞損害有密切關(guān)系。血清TNF-α水平與血清HBV-DNA對數(shù)值之間無顯著相關(guān)性,表明HBV本身不能直接影響血清TNF-α水平。MELD評分是反映肝功能損傷程度的良好指標(biāo),血清TNF-α水平與MELD評分呈明顯的正相關(guān),提示血清TNF-α水平升高能夠間接反映肝功能的惡化。TNF-α可以通過多種信號通路導(dǎo)致肝細(xì)胞的凋亡和壞死,因而它在慢加急性肝衰竭的發(fā)病機(jī)理當(dāng)中具有重要的作用。 2.慢加急性肝衰竭患者TNF-α啟動子甲基化程度較慢乙肝及健康對照組低,且TNF-α啟動子甲基化組血清TNF-α水平較非甲基化組低,DNA甲基化在調(diào)控細(xì)胞因子表達(dá)中起著重要作用。
【圖文】：

重型肝炎患者甲基化組血清TNF一水平明顯低于非甲
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R575.3

【引證文獻(xiàn)】

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1 崔利娟;吳文秀;邢金麗;張秋云;陳煜;;截斷逆挽方對慢加急性肝衰竭大鼠血清、肝組織TNF-α含量及肝組織TNFR1表達(dá)的影響[J];北京中醫(yī)藥;2013年02期

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本文編號：2709887