【摘要】：隨著消化內(nèi)鏡技術的廣泛應用,我國炎癥性腸病(Inflammantory bowel disease,IBD)的檢測率逐年增加,并且IBD患者如不進行及早干預其患結(jié)直腸癌的風險增加,但是目前對炎癥性腸病發(fā)病機制尚缺乏足夠的了解。Erbin(也稱Erbb2ip),最早于1997年作為Erbb2的相互作用蛋白被發(fā)現(xiàn)。它屬于LAP(leucine rich repeat and PDZ domain)蛋白家族的一員。已有的研究表明,Erbin在調(diào)節(jié)細胞增殖分化、心臟發(fā)育、髓鞘形成以及在腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中的發(fā)揮著重要作用。Erbin在IBD的作用如何尚不明確。本文主要探討Erbin在炎癥性腸病中發(fā)揮的作用及其相關機制。前期我們發(fā)現(xiàn),Erbin基因在人炎癥性腸病臨床標本、急性潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸組織及自發(fā)性慢性炎癥性腸病小鼠(IL-10-/-)腸組織中表達均較對照正常結(jié)直腸組織明顯降低。同時我們觀察到,Erbin△c/△c(Erbin PDZ功能域缺失)的小鼠易感炎癥性腸病。本研究中,我們應用crispr/cas9技術構(gòu)建Erbin完全缺失的小鼠模型(Erbin~(-/-)),該小鼠Erbin第16位外顯子一個堿基的缺失,造成移碼突變,蛋白提前終止。利用Erbin~(-/-)小鼠模型,我們進一步明確了Erbin在IBD中的作用并對其機制進行了探討。首先,我們使用DSS誘導類似臨床潰瘍性結(jié)腸炎特征的小鼠腸炎模型。通過監(jiān)測Erbin~(-/-)及Erbin+/+小鼠的體重,比較其腸重與體重比值,及評估腸上皮炎癥范圍,隱窩損傷等,進一步確定Erbin~(-/-)小鼠較Erbin+/+小鼠更易感腸炎隨后,我們分別在體內(nèi)和體外研究Erbin如何抑制炎癥性腸病的發(fā)生。基于C57小鼠構(gòu)建的潰瘍性結(jié)腸炎模型和IL-10-/-小鼠模型,我們發(fā)現(xiàn),兩種模型小鼠其結(jié)直腸Erbin表達下調(diào)、自噬標志物LC3B表達增強。進一步我們發(fā)現(xiàn),與對照組小鼠腸上皮相比較,Erbin~(-/-)小鼠腸上皮其LC3B的表達增強、自噬相關蛋白ATG16L1和ATG2A表達減弱。通過透射電鏡我們檢測到,自噬溶酶體數(shù)目在Erbin~(-/-)小鼠的結(jié)直腸上皮中較對照組小鼠結(jié)腸上皮明顯增多;與野生型小鼠相比,DSS誘導后Erbin~(-/-)小鼠結(jié)直腸上皮中自噬溶酶體數(shù)目明顯增多,并伴有廣泛的線粒體腫脹。體外實驗中,我們應用TNF-α刺激293T細胞模擬體內(nèi)炎癥因子對細胞的損傷。細胞免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn),TNF-α刺激后細胞自噬小體增多。若用TNF-α刺激低表達Erbin的細胞,其自噬小體數(shù)目較單純給予TNF-α刺激明顯增多。RT-PCR檢測證實,自噬小體數(shù)目增多伴有LC3B在轉(zhuǎn)錄水平表達增加。同時,我們用流式細胞技術檢測到TNF-α刺激CT26細胞22小時,細胞死亡率為40%;在敲低Erbin的情況下使用TNF-α刺激該細胞22小時,細胞死亡率達到了90%,提示敲低Erbin會促進TNF-α誘導的細胞死亡。最后,我們用體內(nèi)模型進一步驗證Erbin是否通過抑制自噬通路抑制炎癥性腸病。我們在DSS誘導Erbin~(-/-)小鼠炎癥性腸病模型的同時,用自噬的抑制劑氯喹作用于該小鼠,HE染色發(fā)現(xiàn)與未使用氯喹的Erbin~(-/-)小鼠相比,自噬抑制劑氯喹的使用能顯著減緩改善DSS誘導的Erbin~(-/-)小鼠結(jié)直腸粘膜的炎癥細胞浸潤和隱窩上皮細胞損傷。與此同時,我們檢測到使用氯喹后DSS誘導的Erbin~(-/-)小鼠結(jié)直腸上皮中凋亡相關蛋白表達量較未使用氯喹的DSS誘導Erbin~(-/-)小鼠下降。綜上所述,我們的研究明確了Erbin在炎癥性腸病中的重要作用,并初步發(fā)現(xiàn)Erbin基因可通過抑制細胞自噬性死亡抑制炎癥性腸病的發(fā)生發(fā)展,這為臨床炎癥性腸病的治療提供了新的線索。
【圖文】：

rbin 通過抑制自噬性細胞死亡延緩炎癥性腸病進程的研究 第二第二章 材料與方法1.材料1.1 小鼠Erbin-/-小鼠：SPF級別實驗中心繁育，Erbin完全缺失小鼠�；贑57背景鼠用CRISPR/cas9技術構(gòu)建，A圖中所示Erbin第16位外顯子中A堿基的缺失，，造碼突變，蛋白提前終止。B中WB檢測繁育的Erbin-/-小鼠結(jié)直腸幾乎不表達該。同時RT-PCR檢測繁育的Erbin-/-小鼠結(jié)直腸幾乎不表達該蛋白，*P < 0t-test)。

19圖 1-1 Erbin 缺失后小鼠腸道炎癥反應和上皮損傷情況 （A）3.5 月齡和 9 月齡Erbin-/-小鼠和 Erbin+/+小鼠大體和鏡下 HE 結(jié)直腸變化（B）在 3.5 個月大和 9 個月大的 Erbin-/-和 Erbin+/+小鼠中，炎癥的組織病理學評分，炎癥范圍深度和隱窩損傷。 數(shù)據(jù)表示為每組小鼠的百分比與指示的分數(shù)Figure1-2 Figure 3: Intestinal inflammatory response and epithelial injury inexperimental IBD mouse model after Erbin was deleted. (A) Gross appearance andrepresentative H&E staining of colorectum in 3.5-month-old and 9- month-oldErbin-/-mice and Erbin+/+mice. (B) Histopathological scorings of the inflammation,depth of inflammation, and crypt damage of colorectum in 3.5-month- old and9-month-old Erbin-/-mice and Erbin+/+mice. Data are represented as the percentage ofmice per group with the indicated score.
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R574

【參考文獻】

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1 Lauren Van Der Kraak;Philippe Gros;Nicole Beauchemin;;Colitis-associated colon cancer:Is it in your genes?[J];World Journal of Gastroenterology;2015年41期

本文編號：2704666