【摘要】：研究背景及目的： 近年來,隨著經(jīng)濟水平的提高,生活方式的改變,非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)已成為我國導(dǎo)致慢性肝病的重要原因之一,其中,非酒精性單純性脂肪肝是一種良性病變,而非酒精性脂肪性肝炎則會進展為肝纖維化、肝硬化甚至肝癌等終末期肝病。目前,NAFLD的發(fā)病機制尚不明確,已有一些研究表明,肝細胞凋亡是促進其進展的重要病理生理改變,且程度與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān),但其中的機制仍未完全闡明。研究證實,過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激易導(dǎo)致細胞功能障礙及細胞凋亡,而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的分子伴侶或許可以影響此過程。蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide isomerase, PDI)是一種定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔的分子伴侶,在NAFLD中PDI是否可影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所誘導(dǎo)的細胞凋亡過程,目前尚未見文獻報道。本研究旨在通過體外實驗的方法,探索PDI在此過程中所起的作用,同時試圖闡明其可能的機制。 方法： (1)細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：HL-7702細胞用加入了10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng),并置于含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中。傳代至狀態(tài)良好時,消化后鋪至12孔板中,按LipofectamineTM 2000說明書進行轉(zhuǎn)染操作。72h后改用1mM FFA高脂培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。 (2)油紅O染色：吸去培養(yǎng)基,用PBS輕柔漂洗后加入12%中性甲醛固定15min,然后用油紅稀釋液染色15min,60%異丙醇漂洗后用蘇木素復(fù)染5min,顯微鏡下觀察并拍照。 (3) Western Blot檢測：收集12孔板中的細胞并提取蛋白,將各組蛋白加入相應(yīng)泳道后進行SDS-PAGE電泳,然后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上,封閉1 h,一抗4℃孵育過夜,再用二抗孵育后行ECL法檢測,最后用凝膠成像系統(tǒng)拍照。 (4)細胞凋亡檢測：細胞用冷的PBS洗兩次并重懸后,加入適量的Annexin V和PI染色,混勻后避光孵育15min,孵育后加入1×buffer 400ul,用流式細胞儀完成檢測。 結(jié)果： (1)油紅O染色：與對照組相比,FFA脂變誘導(dǎo)組細胞胞漿內(nèi)可見大量紅染的脂滴,但經(jīng)高脂培養(yǎng)基誘導(dǎo)的三組,即單純FFA誘導(dǎo)組、PDI-negative siRNA+FFA誘導(dǎo)組及PDI-siRNA Mix+FFA誘導(dǎo)組組間差異不明顯。 (2)細胞凋亡結(jié)果：與對照組相比,單純FFA誘導(dǎo)組、PDI-negative siRNA+FFA誘導(dǎo)組、PDI-siRNA Mix+FFA誘導(dǎo)組的細胞凋亡比例依次升高。 (3)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡相關(guān)指標(biāo)：與對照組相比,GRP78在單純FFA誘導(dǎo)組、PDI-negative siRNA+FFA誘導(dǎo)組及PDI-siRNA Mix+FFA誘導(dǎo)組的表達均增高,并以PDI-siRNA Mix+FFA誘導(dǎo)組增高最明顯。而CHOP在對照組、單純FFA誘導(dǎo)組、PDI-negative siRNA+FFA誘導(dǎo)組及PDI-siRNA Mix+FFA誘導(dǎo)組的表達是依次增高的。另外,IRE1在各組表達情況無明顯差異。 結(jié)論： (1)PDI表達下調(diào)能加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激程度； (2)PDI表達下調(diào)能加重由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡； (3)在HL-7702細胞中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能主要通過上調(diào)CHOP表達誘導(dǎo)細胞凋亡發(fā)生； (4) PDI可能不影響細胞發(fā)生單純脂變的過程。
【圖文】：

3.1脂肪變細胞模型的構(gòu)建細胞貼壁后，除對照孔外，余孔改用lmMF隊高脂培養(yǎng)基分別培養(yǎng)24h、48h、72h，到相應(yīng)時間點后用油紅O染色，并用倒置顯微鏡觀察、拍照(圖3.1)。對照組 24hFFA組 48hFFA組 72hFFA組圖3.1高脂培養(yǎng)基誘導(dǎo)的脂變細胞模型對照組:細胞邊緣清晰，胞漿豐富，核膜完整，核大，可見核分裂相，油紅O染色后僅見少量且較小的紅染的脂滴。F隊脂變誘導(dǎo)組:細胞變圓，核大，部分細胞核被擠到一側(cè)，呈印戒樣改變，，胞漿內(nèi)可見大量紅染的脂滴;隨著誘導(dǎo)時間的延長，脂滴逐漸增大。因24h脂變誘導(dǎo)已有較明顯的效果，且有相應(yīng)文獻依據(jù)[9]，故后續(xù)實驗將脂

PDI一siRNA敲低效果檢測
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R575.5

【參考文獻】

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1 鐘英強;魏菁;傅玉如;邵靜;梁倚文;林燕華;劉娟;朱兆華;;陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000對人胰腺癌Capan-2細胞的毒性作用[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2008年11期

本文編號：2702755