【摘要】：目的:1.比較嗜酸乳桿菌、唾液乳桿菌、酪酸梭菌、地衣芽孢桿菌、保加利亞乳桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌對(duì)胃粘膜上皮細(xì)胞的體外粘附能力、對(duì)胃上皮細(xì)胞的毒性作用以及對(duì)幽門螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC43504及臨床分離多重耐藥株粘附胃粘膜上皮細(xì)胞的影響。2.比較嗜酸乳桿菌、唾液乳桿菌、酪酸梭菌、地衣芽孢桿菌、保加利亞乳桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌活菌及不同PH值發(fā)酵上清液對(duì)幽門螺桿菌的抑菌作用。3.篩選出體外具有較強(qiáng)抑制幽門螺桿菌粘附胃粘膜上皮細(xì)胞能力的益生菌,評(píng)價(jià)該益生菌對(duì)幽門螺桿菌脂多糖(LPS)誘導(dǎo)胃粘膜上皮細(xì)胞分泌IL-8的影響。4.評(píng)價(jià)該益生菌對(duì)幽門螺桿菌脂多糖誘導(dǎo)的胃粘膜上皮細(xì)胞TLR4、總NF-κBp65、細(xì)胞核NF-κBp65、IκBα、p-IκBα表達(dá)量的影響,初步探討益生菌調(diào)節(jié)局部胃粘膜炎癥反應(yīng)的機(jī)制。研究方法:1.分離培養(yǎng)嗜酸乳桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌、唾液乳桿菌、地衣芽孢桿菌和酪酸梭菌,采用胃正常上皮細(xì)胞GES-1細(xì)胞系作為體外細(xì)胞模型,用革蘭氏染色法評(píng)估以上7種益生菌菌株的胃粘膜上皮粘附能力,用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)益生菌對(duì)胃上皮細(xì)胞活力的影響;2.提取嗜酸乳桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌、唾液乳桿菌、地衣芽孢桿菌和酪酸梭菌的發(fā)酵液,測(cè)定PH值。從萎縮性胃炎患者胃粘膜分離出多重耐藥HP,對(duì)比HP ATCC43504標(biāo)準(zhǔn)菌株,用瓊脂平板打孔法檢測(cè)這7種益生菌活菌及不同PH值發(fā)酵液對(duì)兩種HP菌株生長的影響;通過尿素-酚紅試驗(yàn)分別觀察益生菌預(yù)處理和后處理對(duì)兩種HP菌株粘附GES-1細(xì)胞的抑制作用;3.提取HP ATCC43504標(biāo)準(zhǔn)株的LPS,測(cè)定LPS濃度;通過第一部分篩選出可有效粘附于GES-1細(xì)胞的益生菌,用ELISA和RT-PCR方法分別檢測(cè)益生菌活菌是否可抑制HP-LPS誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞產(chǎn)生IL-8炎癥因子;4.選擇可抑制HP-LPS誘導(dǎo)GES-1產(chǎn)生IL-8的益生菌,用細(xì)胞免疫組化方法檢測(cè)益生菌對(duì)GES-1細(xì)胞在HP-LPS作用下細(xì)胞膜TLR_4表達(dá)量和NF-κBp65轉(zhuǎn)核情況;用Western blotting方法半定量檢測(cè)細(xì)胞膜TLR_4,細(xì)胞漿IκBα、p-IκBα,總NF-κB p65、細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65表達(dá)量,初步探討益生菌調(diào)節(jié)HP-LPS所致胃粘膜炎癥的作用機(jī)制。結(jié)果:1.革蘭氏染色后油鏡下可見益生菌粘附于GES-1細(xì)胞,不同益生菌粘附指數(shù)有差異,益生菌對(duì)細(xì)胞粘附指數(shù)與對(duì)細(xì)胞粘附率結(jié)果一致:嗜酸乳桿菌保加利亞乳桿菌嬰兒雙歧桿菌長雙歧桿菌唾液乳桿菌地衣芽孢桿菌酪酸梭菌。2.嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、唾液乳桿菌、酪酸梭菌、長雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌在MOI=1:100時(shí),4h內(nèi)對(duì)細(xì)胞無明顯毒性作用,4h細(xì)胞存活率平均在97%以上,組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4h后益生菌開始對(duì)細(xì)胞活性產(chǎn)生影響,細(xì)胞存活率逐漸下降,長雙歧桿菌下降最為明顯,6h細(xì)胞平均存活率為92.0%,地衣芽孢桿菌下降最慢,6h細(xì)胞平均存活率為99.7%。8h后細(xì)胞存活率進(jìn)一步下降,保加利亞乳桿菌組在6—8h內(nèi)細(xì)胞存活率下降幅度最大,8h細(xì)胞平均存活率為82.3%。MOI=1:1000時(shí),2h內(nèi)益生菌對(duì)細(xì)胞無明顯毒性作用,組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,2h后細(xì)胞存活率開始下降,保加利亞乳桿菌組細(xì)胞存活率下降最明顯,4h為10.4%,6h時(shí)已全部死亡。地衣芽孢桿菌較其它乳酸桿菌組細(xì)胞存活率下降慢,6h仍有95.3%細(xì)胞存活,在6h后細(xì)胞存活率開始下降,8h細(xì)胞存活率為42.7%,其余乳酸桿菌組8h細(xì)胞全部死亡。3.嗜酸乳桿菌、酪酸梭菌、嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌、唾液乳桿菌、保加利亞乳桿菌菌懸液均可以抑制HP多重耐藥株和HP ATCC43504標(biāo)準(zhǔn)株的生長,地衣芽孢桿菌菌懸液對(duì)HP多重耐藥株及標(biāo)準(zhǔn)株均無抑制作用。保加利亞乳桿菌組、地衣芽孢桿菌組和其它組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),唾液乳桿菌、長雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、嬰兒雙歧桿菌、酪酸梭菌四組組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。嗜酸乳桿菌、酪酸梭菌、嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌、唾液乳桿菌、保加利亞乳桿菌上清液在PH值≤3時(shí)對(duì)HP有抑制作用,地衣芽孢桿菌的上清液對(duì)HP有生長抑制作用,且不依賴于PH值。4.GES-1細(xì)胞經(jīng)過嗜酸乳桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌、唾液乳桿菌預(yù)處理2h后,HP的粘附率下降,嗜酸乳桿菌組抑制作用最明顯(P0.05)。益生菌對(duì)HP粘附GES-1細(xì)胞的抑制能力:嗜酸乳桿菌保加利亞乳桿菌嬰兒雙歧桿菌長雙歧桿菌唾液乳桿菌。由于酪酸梭菌和地衣芽孢桿菌菌體本身不能粘附于GES-1細(xì)胞,因此不能減少HP的粘附率。益生菌后處理組,HP胃細(xì)胞粘附率未見下降。5.在HP-LPS的刺激下,GES-1細(xì)胞分泌的IL-8量明顯增高,是空白對(duì)照組的近10倍,預(yù)先與保加利亞乳桿菌、唾液乳桿菌作用2h后,GES-1細(xì)胞IL-8的分泌量較HP-LPS減少,保加利亞乳桿菌組作用最明顯,IL-8分泌量減少了50%左右(P0.05)。嗜酸乳桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌預(yù)作用組IL-8分泌量較HP-LPS組略升高,無降低IL-8的作用。6.正常生理情況下,GES-1細(xì)胞核內(nèi)很少表達(dá)NF-κB p65,胞膜上有少量TLR4表達(dá),胞漿內(nèi)有大量IκBα表達(dá),當(dāng)受到HP-LPS刺激60min后,胞漿內(nèi)NF-κB p65開始轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi),TLR_4和p-IκBα表達(dá)增多,IκBα降解(P0.05),3.0*10~(^7)cfu/ml保加利亞乳桿菌預(yù)作用細(xì)胞2h后,NF-κB p65轉(zhuǎn)核量減少(P0.05),TLR_4表達(dá)量減少(P0.05),p-IκBα表達(dá)減少,IκBα降解量減少(P0.05)。結(jié)論:1.嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌對(duì)胃粘膜上皮細(xì)胞有較好的粘附性;在一定濃度內(nèi)(MOI=100)4h對(duì)胃上皮細(xì)胞活力沒有影響。2.嗜酸乳桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌、酪酸梭菌、唾液芽孢桿菌的活菌和發(fā)酵液在PH值≤3時(shí)對(duì)HP多重耐藥株和HP標(biāo)準(zhǔn)株均有一定的生長抑制作用,抑菌物質(zhì)考慮為有機(jī)酸,地衣芽孢桿菌活菌沒有抑制作用,發(fā)酵液有明顯的抑制作用且與PH值無關(guān)。3.嗜酸乳桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌、唾液乳桿菌可預(yù)先占據(jù)胃上皮細(xì)胞粘附位點(diǎn),減少HP的粘附,但HP粘附于細(xì)胞后,益生菌不能將HP排擠出。4.保加利亞乳桿菌可以通過TLR4-NF-κB途經(jīng)減少HP-LPS誘發(fā)的GES-1細(xì)胞IL-8的生成。
【圖文】：

中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文3.1.7 唾液乳桿菌唾液乳桿菌厭氧生長，平板生長形態(tài)（圖 3.1.13）：菌落圓形凸起，乳白色，光滑，有光澤，直徑 1—2mm，挑起托絲粘稠。革蘭氏染色（圖 3.1.14）革蘭氏陽性，呈短桿狀，二端呈圓形，通常單獨(dú)出現(xiàn)，成對(duì)短鏈狀，，無莢膜無芽孢，無鞭毛，不運(yùn)動(dòng)。

中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文3.1.7 唾液乳桿菌唾液乳桿菌厭氧生長，平板生長形態(tài)（圖 3.1.13）：菌落圓形凸起，乳白色，光滑，有光澤，直徑 1—2mm，挑起托絲粘稠。革蘭氏染色（圖 3.1.14）革蘭氏陽性，呈短桿狀，二端呈圓形，通常單獨(dú)出現(xiàn)，成對(duì)短鏈狀，無莢膜無芽孢，無鞭毛，不運(yùn)動(dòng)。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R573

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2698987