【摘要】： 丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)是引起人類丙型肝炎的病原體,其慢性化率高達85%,與肝硬化、肝細胞癌的發(fā)生密切相關,嚴重危害人類健康,已成為全球性的、重要的公共衛(wèi)生問題。迄今,對HCV感染發(fā)病的機制認識不完全清楚,仍然缺乏有效的治療方法,疫苗的研究也遇到很大障礙。在HCV感染過程中,病毒與細胞表面相應受體的結合是病毒感染復制的始動環(huán)節(jié),因此探索HCV的受體在HCV感染發(fā)病中的作用一直是研究的熱點問題。CD81、B族I型清道夫受體(scavenger receptor class B type I, SR-BI)與HCV包膜蛋白結合,參與HCV的入胞過程,目前已經(jīng)證實,CD81和SR-BI同時存在是HCV感染肝細胞的必要條件,但一些非肝源細胞同時表達CD81和SR-BI,仍然不能被HCV感染,說明HCV感染肝細胞可能需要其它特異性因子的共同參與。最新研究發(fā)現(xiàn),肝臟上高度表達的claudin-1在HCV入胞過程中發(fā)揮重要的作用,非肝源細胞在表達該分子后獲得對HCV的易感性。Claudin-1是構成細胞間緊密連接的主要蛋白,有4個疏水的跨膜區(qū),2個細胞外環(huán)結構(extracellular loop, EL),EL1與HCV入胞密切相關,針對claudin-1 EL1的抗體可以阻斷HCV的感染;此外,claudin-1在介導細胞間HCV的傳播中起關鍵作用,細胞間HCV傳播可逃避宿主免疫系統(tǒng)中和抗體的作用,可能是HCV在宿主體內(nèi)持續(xù)存在的重要原因。因此,深入研究claudin-1在HCV感染中的作用,有助于加深對HCV感染發(fā)病機制的理解,為抗病毒治療提供新的思路。 長期以來,缺乏可靠的供病毒繁殖與傳播的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)一直制約著HCV的研究,2005年Rockefeller大學HCV研究中心主任Charles M. Rice教授領導的實驗室報道建立HCV感染細胞模型,解決了這一瓶頸問題。Rice教授惠贈的HCV體外培養(yǎng)系統(tǒng)(cell-culture derived HCV, HCVcc),為我們的研究奠定了良好的基礎。為探討claudin-1在HCV感染中的作用,本研究主要完成了以下三方面的工作: 1 HCV體外培養(yǎng)系統(tǒng) 使用Rice教授惠贈的包含HCV全長序列的2a型J6/JFH嵌合體質粒,酶切線性化后作為模版,在T7 RNA聚合酶的作用下,體外轉錄獲得全長HCV轉錄本,產(chǎn)物經(jīng)RNA電泳鑒定,并電穿孔轉染至Huh-7.5細胞,包裝出病毒顆粒,重新感染原始的(na?ve)Huh-7.5細胞,并檢測病毒感染性。 2 Claudin-1表達對HCVcc易感性的影響 從HepG2細胞中克隆claudin-1基因,插入pEGFP-C3載體中,構建真核表達載體,脂質體法轉染293T細胞,熒光顯微鏡與Western blot觀察claudin-1的表達,檢測claudin-1對HCVcc感染的影響;使用化學合成claudin-1 siRNA序列,抑制Huh-7.5細胞中claudin-1的表達,檢測HCVcc感染性的變化。 3γ干擾素對緊密連接的影響及其對HCV感染的影響γ干擾素是促炎細胞因子,可影響細胞緊密連接;γ干擾素還參與抗HCV免疫應答,本研究對γ干擾素在緊密連接及HCV易感性之間的作用初步探索。Transwell PET膜上培養(yǎng)的腸腺癌細胞系Caco-2細胞可形成極性結構,與體內(nèi)的肝細胞相似,采用實時定量PCR與Western blot檢測Caco-2細胞上的claudin-1、CD81及SR-BI的表達情況。比較Caco-2單層細胞在γ干擾素處理前后跨上皮電阻、FITC標記的葡聚糖滲透性以及Caco-2細胞間緊密連接超微結構的變化,通過激光共聚焦顯微鏡觀察CD81、SR-BI及claudin-1在Caco-2細胞上的分布情況,檢測γ干擾素對HCVcc感染性的影響。 結果: 1通過體外轉錄獲得了FL-J6/JFH全長嵌合體HCV RNA轉錄本,經(jīng)電穿孔轉染Huh-7.5細胞,在培養(yǎng)上清中檢測到HCV,用該培養(yǎng)上清可以感染原始的Huh-7.5細胞。 2從HepG2細胞中克隆claudin-1基因,成功構建了claudin-1的真核表達載體pEGFP-claudin-1,脂質體法轉染293T細胞,48 h后可檢測到融合蛋白EGFP-claudin-1在293T細胞中的表達。293T細胞上外源性瞬時表達claudin-1后,獲得對HCVcc的易感性。 3化學合成的siRNA序列可以有效抑制Huh-7.5細胞上的claudin-1的表達,并阻斷HCVcc對Huh-7.5細胞的感染。 4 Caco-2細胞表達HCV的關鍵受體:CD81、SR-BI及claudin-1,支持HCVcc的感染。 5γ干擾素可以下調(diào)claudin-1的表達,造成Caco-2細胞間緊密連接被破壞,通透性增加。γ干擾素同時影響claudin-1、CD81及SR-BI在細胞上的分布。γ干擾素處理后Caco-2細胞對HCVcc的易感性下降。 結論: 1緊密連結蛋白claudin-1是HCV的重要受體,影響細胞對HCV的易感性,可能與HCV的嗜肝性有關。 2γ干擾素可以降低claudin-1的表達,破壞緊密連接,使CD81及SR-BI的分布發(fā)生變化,可能影響細胞對HCV的易感性。
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13圖 1 HCV 入胞示意圖[13]1.1 CD81CD81 分子是一種非糖基化膜蛋白，有 236 個氨基酸殘基，分子量為25.8 kD。因它對于人 T 淋巴細胞系的增殖反應具有顯著的抑制作用而被命名為抗增生抗體識別的靶抗原（target of antiproliferative antibody-1,TAPA-1），后統(tǒng)一命名為 CD81。它屬于四次跨膜蛋白（teraspanin）超家族（TM4SF）成員，含有 4 個跨膜區(qū)和 2 個胞外區(qū)，N、C 端均在胞內(nèi)。四次跨膜蛋白的基本特征是它們通過同源或是異源蛋白交聯(lián)形成多聚體，在細

第四軍醫(yī)大學博士學位論文NS4B 蛋白是膜蛋白；NS5A 蛋白在細胞中以磷酸化形式存在，可以結合NS5B 蛋白并調(diào)節(jié)其功能，其序列中具有干擾素敏感決定區(qū)。NS5B 蛋白具有 RNA 依賴的 RNA 聚合酶活性（RNA-dependent RNApolymerase, RdRp），負責 HCV 基因組 RNA 的復制[42,43]。3’-NCR 由高變區(qū)、多聚嘧啶區(qū)(polyU/UC)組成，對 RNA 復制起關鍵作用。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R512.63

【參考文獻】

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本文編號：2694094