【摘要】： 研究背景和目的:PD是ESRD患者的主要腎替代治療方法之一。但是長期暴露于生物不相容性的PDF中的腹膜易損傷,逐漸進(jìn)展為腹膜纖維化,導(dǎo)致超濾失敗,溶質(zhì)清除障礙,影響PD療效。高糖環(huán)境上調(diào)TGF-β_1的表達(dá)并誘導(dǎo)HPMCs發(fā)生EMT是腹膜纖維化啟動和維持的關(guān)鍵過程。而目前認(rèn)為HGF和TGF-β_1之間的平衡在決定損傷組織是痊愈還是纖維化起著關(guān)健的作用。眾多研究表明,HGF是內(nèi)在的抗纖維化因子。本研究主要探討外源性HGF能否影響高糖環(huán)境培養(yǎng)下的HPMCs的TGF-β_1表達(dá),并阻止HPMCs發(fā)生EMT,減少ECM的合成。探討HGF對腹膜纖維化的防治作用,為保護(hù)長期PD患者的腹膜功能提供新的治療策略。 方法:通過胰蛋白酶消化法從人大網(wǎng)膜組織中分離出HPMCs并進(jìn)行原代培養(yǎng),通過形態(tài)學(xué)和免疫組化進(jìn)行腹膜間皮細(xì)胞鑒定,取第三代細(xì)胞用于實驗。細(xì)胞亞融合后在無血清培養(yǎng)基中同步化24小時,然后在不同葡萄糖濃度環(huán)境(5.5,30,60mmol/LD-葡萄糖,54.5mmol/L甘露醇)及高糖環(huán)境中(60mmol/L D-葡萄糖)加入不同濃度的rhHGF(25,50,100ng/ml)培養(yǎng)48小時。ELISA方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液TGF-β_1、FN蛋白水平,免疫組化方法檢測HPMCs之α-SMA的蛋白表達(dá),并通過IOD測定進(jìn)行半定量分析。通過熒光定量PCR檢測HPMCs之TGF-β_1,FN,α-SMA mRNA的表達(dá)。 結(jié)果:1、原代培養(yǎng)的HPMCs開始以梭形的成纖維細(xì)胞樣生長,約一周后融合并表現(xiàn)為“鋪路石”狀,免疫組化顯示角蛋白和波形蛋白表達(dá)陽性。2、在高糖環(huán)境培養(yǎng)下的HPMCs之α-SMA、TGF-β_1、FN蛋白和基因表達(dá)水平與對照組比較都明顯增加(P＜0.05),并呈劑量依賴關(guān)系(P＜0.01)。甘露醇組與對照組比較無明顯增加。3、HGF在蛋白和基因水平可抑制高糖誘導(dǎo)的HPMCs之α-SMA、TGF-β_1、FN表達(dá)(P＜0.05),并呈劑量依賴關(guān)系(P＜0.01)。 結(jié)論:1、HPMCs在高糖環(huán)境培養(yǎng)下,TGF-β_1的表達(dá)上調(diào),并誘導(dǎo)了HPMCs的EMT,促進(jìn)HPMCs合成ECM。2、外源性的HGF可抑制高糖誘導(dǎo)的HPMCs TGF-β_1的表達(dá),并阻止HPMCs的EMT和減少ECM的分泌,提示HGF具有抑制腹膜纖維化的生物學(xué)功能,為臨床防治PD相關(guān)的腹膜纖維化提供理論依據(jù)和新的治療思路。
【圖文】：

1.細(xì)胞生長情況原代消化下的細(xì)胞在12一36小時后逐漸貼壁并完全伸展，細(xì)胞開始以梭形的成纖維細(xì)胞樣生長，細(xì)胞形態(tài)、大小不一(見圖1一l)。經(jīng)6一7天的培養(yǎng)后，細(xì)胞生長并逐步融合成單層，細(xì)胞表現(xiàn)為多邊形的上皮細(xì)胞形態(tài)，大小形態(tài)較為一致，在倒置相差顯微鏡下顯示呈現(xiàn)典型的“鋪路石樣”外觀(見圖1一2，1一3)。上述生長特點符合文獻(xiàn)報道的腹膜間皮細(xì)胞的生長特征[9一‘0]。2.免疫組織化學(xué)染色鑒定免疫組化結(jié)果顯示，培養(yǎng)的第二代人腹膜間皮細(xì)胞角蛋白、波形蛋白抗原表達(dá)均陽性(見圖1一4，1一5)，兩種染色均為胞漿著色，呈棕黃色，胞核中未見，這兩種蛋白同時陽性被認(rèn)為是間皮細(xì)胞的特征，排除成纖維細(xì)胞。第VIII因子相關(guān)抗原、白細(xì)胞CD45抗原表達(dá)陰性(見圖1一6)

在低濃度的葡萄糖環(huán)境培養(yǎng)下，只有少量的HPMCs表達(dá)a一SMA，隨著葡萄糖濃度的增高，a一SMA陽性HPMCs細(xì)胞數(shù)明顯增多，并巨一些陽性細(xì)胞明顯肥大、拉長，部分有多個細(xì)胞核(見圖2一1一2一4)，通過軟件測得各組表達(dá)a一SMA陽性區(qū)域IOD值顯示，兩個高糖組的平均IOD值較低糖對照組明顯升高，并有統(tǒng)計學(xué)差異(P<O.01)，甘露醇組與低糖對照組比較無顯著性差異(P=0.078)，而且平均IOD值與葡萄糖濃度呈劑量依賴正相關(guān)(r=0.960，P<0.01)，見表2一l。2.HGF對高糖環(huán)境培養(yǎng)下的班姍C(jī)s表達(dá)Q一SMA的影響在高糖環(huán)境培養(yǎng)下的HPMCs加入不同濃度HoF后
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R587.2;R572

【參考文獻(xiàn)】

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1 凌光輝;劉伏友;彭佑銘;段紹斌;李軍;陳星;;短發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA對人腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子-β_1表達(dá)和超微結(jié)構(gòu)的影響[J];中國血液凈化;2007年09期

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本文編號：2688818