發(fā)布時間：2020-05-30 13:33

【摘要】： [研究背景及目的] 我國是HBV感染的高發(fā)地區(qū),1-59歲人群攜帶率約7.18%,由HBV感染導致的重型肝炎或肝功能衰竭仍然是我國臨床常見急危重疾病。我國學者將肝功能衰竭的臨床分型定為：急性肝衰竭(Acute Liver Failure or Fulminant Hepatits, FHF)、亞急性肝衰竭(Subacute Liver Failure, SALF)、慢加急性肝衰竭(Acute-on-Chronic Liver Failure, ACLF)和慢性肝衰竭(Chronic Liver Failure, CLF),其病情兇險,特別是急性肝衰竭死亡率高達70%-90%,臨床上缺乏特異、有效的治療手段和干預靶點,除非緊急實施肝移植(國外以肝移植為主要治療手段,肝移植后5年存活率約為50%～60%),大部分患者預后不良,并發(fā)癥多。 病毒性重型肝炎的發(fā)病機制十分復雜,一般認為是病毒和宿主的相互作用的結(jié)果,現(xiàn)今較為公認的是“兩次損傷學說”,即由病毒直接或間接(免疫反應)所致的原發(fā)性損傷和內(nèi)毒素—細胞因子軸—肝損傷學說為核心的繼發(fā)性損傷,加之患者肝臟儲備功能較差更易導致乙型肝炎重癥化。在國外,重型肝炎多由藥物性因素引起,而在我國則多由HBV感染所致。由于HBV病毒是一種非溶細胞性嗜肝病毒,感染后造成肝損傷的主要機制是機體的免疫系統(tǒng)主動清除被感染的肝細胞,因而對HBV感染后機體免疫功能的研究對于闡述乙型肝炎的發(fā)病和進展等方面的機制具有針對性的作用。 在本實驗室的前期工作中,我們利用人全基因組芯片技術(shù)(8600個探針),分析了重型乙型肝炎患者和輕中度慢性乙型肝炎患者外周血淋巴細胞(PBMC)的基因差異表達譜,篩選出了在重型肝炎中高表達的263種基因,涉及多個類別。KCTD9 (Potassium Channel Tetramerisation Domain Containning 9)和KCNJ15 (Potassium Inwardly-rectifying Channel, Subfamily J, Member 15)是其中的兩種與離子通道相關(guān)的基因,在重型肝炎中這兩種基因表達分別上調(diào)6倍和7倍,通過后續(xù)的擴大樣本的驗證實驗證實了該結(jié)果的可靠性。進一步從基因和蛋白水平,我們檢測了265例臨床不同類型HBV感染患者包括輕中度和重型乙型肝炎患者、以及健康對照人群的肝組織和PBMC中KCTD9分子的表達水平,發(fā)現(xiàn)其僅在重型乙型肝炎患者有顯著高表達,提示其與病毒性乙型肝炎疾病嚴重程度的相關(guān)性。為深入探討KCTD9分子在重型乙型肝炎發(fā)生發(fā)展中的作用及可能的機制,我們利用本實驗室建立的MHV-3誘導的Balb/cJ小鼠暴發(fā)型肝炎模型開展了研究,發(fā)現(xiàn)KCTD9分子在MHV-3病毒感染后的小鼠肝組織和肝臟淋巴細胞尤其是NK細胞中高度表達,與前期人類重型乙型肝炎的研究結(jié)果相似,提示可利用該模型深入剖析KCTD9參與HBV病毒誘導的重型肝炎肝細胞損傷的發(fā)生發(fā)展機制。 我們的前期工作首次表明,在病毒誘導的急性肝衰竭中肝臟NK細胞通過Fas/FasL和NKG2D/NKG2DL途徑增強對肝細胞的殺傷,本研究的主要目標是進一步闡明肝臟NK細胞在急性肝衰竭中的作用及作用機制,研究NK細胞高表達KCTD9分子在肝細胞損傷和重型肝炎發(fā)生發(fā)展過程的作用及作用機制。具體研究內(nèi)容如下： 一、NK細胞在重型病毒性肝炎中的作用及其免疫學機制研究 1、在HBV-ACLF患者肝組織中檢測NK細胞的分布,同時在外周血NK細胞中檢測FasL、NKP30和NKP46的表達,探討NK細胞參與重型乙型肝炎急性肝損傷的機制； 2、在MHV-3誘導的Balb/cJ小鼠暴發(fā)型肝炎模型中,體內(nèi)耗竭NK細胞,觀察干預效果,探討NK細胞參與急性肝損傷的作用。 二、NK細胞新型分子KCTD9在重型乙型肝炎中的作用及其免疫學機制研究 1、以重型乙型肝炎患者為對象的研究 (1)收集重型乙型肝炎患者和輕中度慢性乙型肝炎患者外周血PBMC,對表達KCTD9的淋巴細胞亞群進行定位。 (2)分析表達KCTD9分子的外周血NK細胞與重型乙型肝炎肝損傷嚴重程度的相關(guān)性。 2、利用人NK92細胞系進行KCTD9分子的體外功能研究。 3、以MHV-3誘導的Balb/cJ小鼠暴發(fā)型肝炎模型為對象的研究。 (1)構(gòu)建針對小鼠KCTD9的shRNA干擾質(zhì)粒,非相關(guān)干擾質(zhì)粒以及小鼠KCTD9的全長表達質(zhì)粒,觀察在小鼠暴發(fā)型肝炎模型中干擾或過表達KCTD9對于疾病病程的影響。 (2)在小鼠暴發(fā)型肝炎模型中觀察干擾或過表達KCTD9對于淋巴細胞功能的影響,研究KCTD9參與暴發(fā)型肝炎NK細胞介導的急性肝損傷的作用機制。 [研究方法] 1、利用免疫組織化學技術(shù),檢測HBV-ACLF患者和輕中度CHB患者肝組織中NK細胞的表達頻數(shù)；利用流式細胞術(shù)分析HBV-ACLF患者和輕中度CHB患者外周NK細胞FasL、NKP30和NKP46的表達情況。利用尾靜脈注射抗ASGM-1抗體耗竭NK細胞,觀察MHV-3誘導的Balb/cJ小鼠暴發(fā)型肝炎模型的生存率； 2、利用流式細胞術(shù)檢測KCTD9分子在重型乙型肝炎患者和輕中度慢性乙型肝炎患者PBMC中NK細胞、CD4+T細胞和CD8+T細胞的表達水平,并收集病例資料,統(tǒng)計分析表達KCTD9的NK細胞比例與肝損傷嚴重程度的相關(guān)性。同時利用免疫組織化學技術(shù)檢測重型乙型肝炎患者肝組織連續(xù)切片中NK細胞表達KCTD9的情況。 3、利用NK92細胞系,將人KCTD9表達質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染入該細胞,流式細胞術(shù)觀察轉(zhuǎn)染24小時后NK92細胞KCTD9蛋白和活化分子CD69的表達；將轉(zhuǎn)染后的NK92細胞與HepG2.2.15細胞按照梯度效靶比共培養(yǎng),通過測定ALT釋放量,計算NK92細胞的殺傷效率；ELISA法檢測轉(zhuǎn)染后NK92細胞分泌IFN-γ和TNF-α的情況；利用流式細胞術(shù)篩選轉(zhuǎn)染后NK92細胞的活化性／抑制性受體表達譜。 4、構(gòu)建針對小鼠KCTD9的shRNA干擾質(zhì)粒和全長表達質(zhì)粒,利用尾靜脈高壓注射技術(shù),將KCTD9干擾質(zhì)�；虮磉_質(zhì)粒注射入MHV-3誘導的暴發(fā)型肝炎模型小鼠體內(nèi),從小鼠的生存情況、血清轉(zhuǎn)氨酶水平、肝臟組織學改變等方面研究KCTD9分子在暴發(fā)型肝炎疾病病程中的作用。流式細胞術(shù)檢測shRNA干擾對于本模型小鼠肝臟NK細胞活化和KCTD9表達的影響,利用磁珠分選技術(shù)將肝臟NK細胞分離純化,體外檢測其針對MHV-3感染的肝細胞的殺傷活性。流式細胞術(shù)檢測shRNA干擾后肝臟NK細胞分泌的細胞因子(IFN-γ和TNF-α)水平。 [實驗結(jié)果] 1、NK細胞在病毒誘導的急性肝衰竭肝損傷中發(fā)揮重要作用。免疫組織化學檢測結(jié)果顯示,HBV-ACLF患者肝組織中NK細胞的表達顯著高于輕中度CHB患者；FasL在HBV-ACLF患者肝組織中的表達顯著高于輕中度CHB患者；表達NKP30、NKP46和FasL的外周NK細胞比例以及MFI水平均高于輕中度CHB患者。在MHV-3誘導的Balb/cJ小鼠暴發(fā)型肝炎模型中,耗竭NK細胞可以使該模型動物生存率由0顯著上升到22.2%。 2、KCTD9在HBV-ACLF患者外周血淋巴細胞的表達增高,以NK細胞最為顯著。HBV-ACLF患者(15例)外周血中,表達KCTD9分子的NK細胞和CD4+T細胞的比例顯著高于輕中度CHB患者(21例),而CD8+T細胞的比例無顯著差義；HBV-ACLF患者外周NK、CD4~+T和CD8+T細胞表達KCTD9的平均熒光強度(MFI)水平均顯著高于輕中度CHB患者。將15例HBV-ACLF患者表達KCTD9的外周NK細胞比例與患者臨床指標進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),其與ALT和AST水平高度正相關(guān),而與Tbil、Dbil、ALB、PTA、HBV DNA以及年齡無相關(guān)性,提示KCTD9可能參與了NK細胞介導的肝細胞損傷及重型肝炎的發(fā)生。 3、KCTD9通過下調(diào)NKG2A表達在體外促進NK92細胞活化。利用人KCTD9表達質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染NK92細胞系24小時后,NK92細胞表達KCTD9分子和活化標志CD69分子水平均顯著增加；其在體外針對HepG2.2.15細胞的殺傷功能顯著增強：IFN-γ分泌增加；對系列NK細胞活化性／抑制性受體檢測后發(fā)現(xiàn)NKG2A的表達顯著下調(diào)。 4、針對KCTD9的治療性shRNA干擾延緩MHV-3誘導的暴發(fā)型肝炎疾病進展。成功構(gòu)建小鼠KCTD9表達質(zhì)粒、針對小鼠KCTD9的shRNA干擾質(zhì)粒和非相關(guān)對照干擾質(zhì)粒。利用構(gòu)建的干擾質(zhì)粒尾靜脈高壓注射MHV-3感染的Balb/cJ小鼠,可以使小鼠肝臟KCTD9的表達顯著下調(diào)；小鼠的生存率由0上升到22.2%：血清轉(zhuǎn)氨酶水平顯著下降；小鼠肝組織的病理情況得到改善。KCTD9表達質(zhì)粒注射組小鼠疾病病情加重。 5、針對KCTD9的治療性shRNA干擾降低肝臟NK細胞活化和殺傷功能。與非相關(guān)對照組相比,MHV-3感染后72小時shRNA干擾組肝臟NK細胞表達KCTD9和CD69分子均顯著下降；分離純化的肝臟NK細胞對感染后48小時肝細胞的殺傷效率顯著降低；肝臟NK細胞分泌IFN-γ和TNF-α顯著下降。KCTD9表達質(zhì)粒注射組小鼠肝臟NK細胞活化和各項功能均顯著增強。 [結(jié)論] 1、本研究在人類HBV-ACLF疾病及小鼠暴發(fā)型肝炎模型中證實了NK細胞在肝臟組織中大量存在,活化的肝臟NK細胞可通過增強表達的FasL發(fā)揮殺傷功能,進而在病毒誘導的急性肝損傷中發(fā)揮重要作用。 2、體外研究闡明了KCTD9分子通過降低NKG2A受體的表達促進NK細胞活化,從而誘導之后的殺傷及細胞因子分泌功能。 3、本研究闡明了KCTD9通過活化NK細胞從而參與病毒誘導的急性肝細胞損傷及重型肝炎發(fā)生發(fā)展過程中。 4、小鼠暴發(fā)型肝炎模型中,干預KCTD9的表達可以通過降低肝臟NK細胞的活化而有效延緩病情進展,提高生存率,為重型肝炎的診斷和治療提供了新的分子靶點和理論依據(jù)。
【圖文】：

表4利用Image一P，Plus6.0半定量分析切片中NK細胞表達。輕中度慢性肝炎患者重型肝炎患者l_0116.0104.02.63.06.026.02.015.05.02.0126.094.0120.0119.082.4100.069.672.0103.054.070.063.090.045.0101.092.07.073.0103.0

重型乙型肝炎和輕中度慢性乙型肝炎患者肝組織中FasL的表達，發(fā)現(xiàn)重型肝炎患者肝臟中FasL大量表達，表達的部位多在壞死灶及其周圍浸潤的炎性細胞上，而慢性肝炎中也可見表達，但是表達量顯著少于重型肝炎患者肝組織(圖7)。悅;七妾云、’介獷、.矛，，，，’‘戶”棄戶“二·氣龍一熊，二價材沙一冬飛農(nóng)，_‘二:::J價忿稱.飛氣‘，丫圖7重型乙型肝炎和輕中度慢性乙型肝炎患者的肝組織中FasL的表達:a和b分別為200x和400x實驗陰性對照，c和d分別為200x和400義輕中度慢性肝炎患者肝組織，e和f分別為200義和400x重型肝炎患者肝組織。黑色箭頭標注的棕色區(qū)域即為FasL的表達。5、重型乙型肝炎和輕中度慢性乙型肝炎患者外周血NK細胞FasL的表達。在前期研究中
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R512.6

【引證文獻】

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本文編號：2688200