【摘要】： N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)是一種誘變劑,通過MNNG飲用水或直接灌胃可誘導(dǎo)出胃癌,但其具體致癌機制及對機體有無其它作用至今仍不清楚。近年來不管是基礎(chǔ)科研還是臨床實踐,人們都發(fā)現(xiàn)誘變劑并不象傳統(tǒng)認識的僅僅具有致癌作用,它們除了干擾細胞代謝、畸變?nèi)旧w外,還可以抑制細胞增生、誘導(dǎo)細胞凋亡、提高免疫功能,因此,誘變劑對機體的作用是復(fù)雜的,除了長期以來形成的單一致癌認識外,也許還有不為我們所知的其它作用。端粒酶是一種核糖核蛋白,與細胞癌變密切相關(guān),有學(xué)者報道85%~90%的癌細胞端粒酶表達陽性。在端粒酶3種結(jié)構(gòu)成分中,其逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)最為關(guān)鍵,是端粒酶表達的限速酶,二者呈正相關(guān),而在hTERT轉(zhuǎn)錄表達過程中,其基因啟動子區(qū)是否發(fā)生甲基化又是一個重要的調(diào)控因素,對hTERT表達與否起重要作用。 鑒于以上認識,本課題采用原代培養(yǎng)人正常胃黏膜上皮細胞,觀察MNNG對其端粒酶活性和hTERT表達影響,并對干預(yù)后hTERT基因啟動子區(qū)進行甲基化分析,以了解MNNG干預(yù)后人正常胃黏膜上皮細胞端粒酶活性變化及引起這種變化的機制,以期為MNNG致胃癌機制的進一步研究提供實驗依據(jù),為MNNG對機體的全面作用研究打下一定基礎(chǔ)。實驗方法和結(jié)果如下: 一、成人正常胃黏膜上皮細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定 磁性攪拌酶分離法培養(yǎng)成人正常胃黏膜上皮細胞。細胞活力在第4d達到最高點,BrdU孵育有33.3%的細胞處于細胞周期S期和曾經(jīng)處于S期;接種密度高時細胞PAS反應(yīng)都呈陽性,培養(yǎng)3天大部分細胞CK-18陽性;透射電鏡可見細胞微絨毛、分泌顆粒、連接復(fù)合體等上皮細胞特征。 二、MNNG對人正常胃黏膜上皮細胞端粒酶活性和hTERT表達影響 采用端粒重復(fù)序列擴增法(TRAP)檢測MNNG干預(yù)后人正常胃黏膜上皮細胞端粒酶活性,半定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、western blot和免疫細胞化學(xué)檢測hTERT表達水平,發(fā)現(xiàn)原代培養(yǎng)人正常胃黏膜上皮細胞同癌細胞一樣表達端粒酶,MNNG干預(yù)結(jié)果也與習(xí)慣認識不同,不但不增強端粒酶活性,6.8uM和68uM兩個濃度組都使細胞端粒酶活性下降。MNNG干預(yù)后hTERT mRNA和hTERT蛋白表達變化與端粒酶變化一致。 三、MNNG干預(yù)后人正常胃黏膜上皮細胞hTERT基因啟動子區(qū)甲基化分析 采用甲基化特異性PCR(MSP)和亞硫酸氫鈉修飾測序(BSP)兩種方法檢測hTERT基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài),發(fā)現(xiàn)未干預(yù)人正常胃黏膜上皮細胞同癌細胞一樣hTERT基因啟動子區(qū)CpG全部甲基化,MNNG干預(yù)后大部分CpG去甲基化。所檢測靶序列中含兩個髓樣特異性鋅指蛋白-2(MZF-2)結(jié)合基序,甲基化可以阻礙MZF-2轉(zhuǎn)錄因子與其DNA基序的結(jié)合。 以上結(jié)果提示:1、磁性攪拌酶消化法是一種簡單可靠的胃黏膜上皮細胞原代培養(yǎng)方法,所得細胞從數(shù)量和純度上能滿足一般實驗要求。2、正常細胞多檢測不到端粒酶活性,但原代培養(yǎng)人正常胃黏膜上皮細胞表達端粒酶且其活性與SGC-7901癌細胞株相似;hTERT表達亦如此。MNNG對二者的表達都有抑制作用。3、hTERT基因表達與其啟動子區(qū)甲基化成正相關(guān),MNNG對人正常胃黏膜上皮細胞hTERT啟動子區(qū)具有去甲基化作用,其對端粒酶和hTERT的表達抑制可能通過這種去甲基化機制實現(xiàn)。4、甲基化可以通過抑制轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合活性實現(xiàn)表達調(diào)控,MZF-2是一種負調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子,MNNG干預(yù)后其結(jié)合基序附近CpG位點發(fā)生去甲基化,可能使MZF-2結(jié)合活性增強,因此MZF-2可能參與了由去甲基化介導(dǎo)的端粒酶和hTERT表達抑制。
【圖文】：

圖 1-4 實驗組 圖 1-5 替代對照圖 1-4 培養(yǎng)第 2d BrdU 孵育 18h 胃黏膜上皮細胞 AEC 顯色，核紅染者為處于 S 期和曾經(jīng)處于 S 期細胞(×400)。圖 1-5 為替代對照(×400)。三、PAS 反應(yīng)培養(yǎng)第 2、5d 胃黏膜上皮細胞都呈以下結(jié)果：接種密度高時細胞都染成紫紅色，，高倍鏡下可見胞核旁黏原小滴(圖 1-6、1-7)。接種密度低時成團的細胞 PAS 反應(yīng)都呈陽性，而散在分布的幾乎不著色。經(jīng)唾液消化過的對照組細胞不著色(圖 1-8)

圖 1-4 實驗組 圖 1-5 替代對照圖 1-4 培養(yǎng)第 2d BrdU 孵育 18h 胃黏膜上皮細胞 AEC 顯色，核紅染者為處于 S 期和曾經(jīng)處于 S 期細胞(×400)。圖 1-5 為替代對照(×400)。三、PAS 反應(yīng)培養(yǎng)第 2、5d 胃黏膜上皮細胞都呈以下結(jié)果：接種密度高時細胞都染成紫紅色，高倍鏡下可見胞核旁黏原小滴(圖 1-6、1-7)。接種密度低時成團的細胞 PAS 反應(yīng)都呈陽性，而散在分布的幾乎不著色。經(jīng)唾液消化過的對照組細胞不著色(圖 1-8)
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R573

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 郭禮和;;人羊膜上皮細胞具有胚胎干細胞和移植免疫耐受等優(yōu)良特性[J];中國細胞生物學(xué)學(xué)報;2011年04期

2 任青;陳永利;黃光榮;周希;胡平;;兔子宮內(nèi)膜干細胞的鑒定[J];南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2011年09期

3 谷蘭芝;;Sysmex UF-50全自動尿沉渣分析儀檢測尿管型陽性結(jié)果的探討[J];內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志;2011年06期

4 高元妹;張平;夏e

本文編號：2687691