【摘要】：目的:急性肝損傷是各種因素導(dǎo)致的肝臟急性損害,轉(zhuǎn)氨酶升高,肝功能異常。雙環(huán)醇已在臨床上廣泛應(yīng)用,有明確的保肝降酶效果。既往已發(fā)現(xiàn)的雙環(huán)醇保肝機(jī)制有:保護(hù)肝細(xì)胞膜和線粒體功能,清除自由基,抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,誘導(dǎo)熱休克蛋白表達(dá),抑制炎癥因子釋放等。自噬是真核細(xì)胞在遭遇饑餓、損傷、缺氧等影響細(xì)胞生存的條件下產(chǎn)生的一種自我保護(hù)機(jī)制。既往研究中發(fā)現(xiàn)在急性肝損傷中有自噬的發(fā)生。雙環(huán)醇保肝機(jī)制是否有自噬參與研究尚少。本研究用CCl_4誘導(dǎo)C57BL/6小鼠急性肝損傷并加用雙環(huán)醇預(yù)保護(hù),評估雙環(huán)醇對小鼠肝臟自噬通路及抗氧化應(yīng)激相關(guān)通路指標(biāo)的影響。探索自噬及抗氧化應(yīng)激在雙環(huán)醇保肝機(jī)制中所起的作用。方法:1、動(dòng)物實(shí)驗(yàn):腹腔注射體積比50%的CCl_4 40ul誘發(fā)急性肝損的模型。30只6-8周齡的雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分成五組:正常組,CCl_4 24 h組,CCl_4 48 h組,CCl_4+雙環(huán)醇24 h組,CCl_4+雙環(huán)醇48 h組。于CCl_4給藥后24h、48h分別處死相應(yīng)組小鼠,留取血及肝臟標(biāo)本,檢測血清ALT變化。HE染色評價(jià)鼠肝的病理結(jié)構(gòu)的變化。Western Blot檢測肝臟自噬通路相關(guān)蛋白Atg12、Atg7、Atg5、p62、LC3、Beclin-1、mTOR等的改變情況。透射電鏡觀察肝細(xì)胞內(nèi)自噬體及自噬溶酶體的變化。RT-PCR檢測抗氧化應(yīng)激相關(guān)分子在mRNA水平的變化。2、細(xì)胞實(shí)驗(yàn):使用HepG2細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞損傷模型,雙環(huán)醇或3-MA預(yù)先處理。CCl_4刺激2h后提蛋白,Western Blot檢測mTOR、p62、LC3等自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。將已構(gòu)建好的GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)HepG2細(xì)胞,單用雙環(huán)醇刺激及合用雙環(huán)醇和3-MA刺激細(xì)胞進(jìn)行比較。熒光顯微鏡下觀察拍照并計(jì)數(shù)綠色熒光點(diǎn)的數(shù)量。3、全部數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS20.0軟件分析,p0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,通過血清學(xué)分析發(fā)現(xiàn),CCl_4造模組小鼠血清ALT較正常組明顯升高(P0.001),CCl_4造模后雙環(huán)醇治療組ALT較造模組顯著降低(P0.001)。通過病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn),正常組小鼠肝臟病理未見異常,CCl_4造模組小鼠肝臟病理可見細(xì)胞變性壞死,雙環(huán)醇治療組病理顯示變性壞死得到明顯修復(fù)。2、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,將肝組織蛋白提取,進(jìn)行自噬相關(guān)蛋白分析發(fā)現(xiàn),與正常組和CCl_4造模48h組比,雙環(huán)醇治療24h及48h組Atg7、LC3 II、Beclin-1、p62在蛋白水平明顯升高,P-mTOR明顯下降(P0.05)。CCl_4造模24h組也可見p62及LC3 II蛋白水平升高。Atg5和Atg12未見顯著改變。3、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,提取肝組織mRNA,進(jìn)行基因水平分析發(fā)現(xiàn),與正常組和CCl_4造模組比,CCl_4+雙環(huán)醇治療組肝組織的抗氧化應(yīng)激相關(guān)分子HO-1、NQO1、GSTA-1在mRNA水平明顯升高,Keap1及p62在mRNA水平也上調(diào)(P0.01)。4、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,與正常組相比,CCl_4+雙環(huán)醇治療組p62、P-mTOR蛋白水平下調(diào),LC3 II上調(diào)(P0.05),以上變化可被自噬抑制劑3-MA逆轉(zhuǎn)。熒光顯微鏡下進(jìn)一步驗(yàn)證,向HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染載有GFP-LC3基因的質(zhì)粒,雙環(huán)醇治療組綠色熒光點(diǎn)(表示自噬體)較正常組明顯增多,加3-MA抑制后熒光點(diǎn)數(shù)量減少(P0.01)。結(jié)論:在急性肝損傷治療中,雙環(huán)醇可使血清ALT明顯下降,使變性壞死的肝組織明顯改善。這種改善與自噬通路相關(guān),其中自噬相關(guān)蛋白Atg7、LC3 II、Beclin-1、p62、P-mTOR起到關(guān)鍵作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)該通路中p62與Keap1-Nrf2抗氧化應(yīng)激通路有關(guān),與其下游HO-1、NQO1、GSTA-1分子相關(guān),進(jìn)而使肝細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力增強(qiáng)�？傊�,雙環(huán)醇通過上調(diào)肝細(xì)胞自噬水平及加強(qiáng)抗氧化應(yīng)激能力來保護(hù)CCl_4誘導(dǎo)的急性肝損傷。
【圖文】：

前言毒感染、化學(xué)性毒物、肝毒性藥灌注損傷等原因引起的肝功能異酶升高，影響肝細(xì)胞功能，可發(fā)合物，其誘導(dǎo)的肝損傷模型是一最終進(jìn)入肝內(nèi)，經(jīng)肝微粒體細(xì)胞·和過氧化三氯甲基自由基 OO質(zhì)網(wǎng)膜上的磷脂分子發(fā)生共價(jià)結(jié)影響線粒體代謝，，產(chǎn)生活性氧，等最終引起廣泛肝損傷[3]。

真核細(xì)胞內(nèi)自噬的基本過程
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R575

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 劉詩o

本文編號(hào)：2686711