【摘要】：研究背景：肝纖維化(hepatic fibrosis, HF)是多種慢性肝臟疾病發(fā)生發(fā)展的共同病理基礎,是形成肝硬化的必經(jīng)病理階段。肝纖維化的實質是肝臟細胞外基質(ECM)的過度沉積,其中心環(huán)節(jié)是處于靜止期的肝星狀細胞(hepatic stellate cells, HSCs)的活化和向肌成纖維樣細胞、成纖維細胞的轉化,導致大量細胞外基質的合成；與此同時,細胞外基質的降解減少,由此導致了其合成與降解的不平衡促進了肝纖維化的形成。因此抑制激活的HSCs細胞的活化、增殖及促進HSCs細胞的凋亡成為治療肝纖維化的重要途徑。 目的：CIP-A5是基于基質金屬蛋白酶(MMP-2、MMP-9)的結構而設計的N1-乙酰基取代吡咯烷類化合物的衍生物,一直被視為一種治療肝硬化的候選化合物。本實驗以體外培養(yǎng)大鼠肝星狀細胞株(HSC-T6)為研究對象,觀察CIP-A5對HSC-T6細胞株的增殖、凋亡及相關纖維化細胞因子的影響,從分子生物學水平闡明CIP-A5抗纖維化的作用機制。 方法： 1.明膠酶活性篩選實驗：化合物活性篩選實驗,以琥珀酰明膠降解法檢測化合物CIP-A5對人Ⅳ型膠原酶活性抑制作用；以SDS-PAGE明膠酶譜分析HSC-T6細胞培養(yǎng)上清液MMP-2、MMP-9水平,評價化合物對酶活性的影響。 2.化合物CIP-A5對大鼠肝星狀細胞增殖與凋亡的影響：研究CIP-A5抗肝纖維化作用,分別采用MTT法觀察其對HSC-T6生長抑制作用；采用流式細胞術觀察其誘導HSC-T6細胞凋亡的影響；以臺盼藍染色法,檢查化合物處理后藍染細胞的比例,評價化合物對肝星狀細胞抑制作用性質。 3.化合物CIP-A5對大鼠肝星狀細胞相關纖維化細胞因子表達水平的影響：以免疫印跡法檢測CIP-A5對活化的肝星狀細胞HSC-T6中MMP-2、MMP-9及相關纖維化細胞因子TGF-p、TNF-α、CTGF的表達水平,評估CIP-A5作為一種新型化合物用于抗肝纖維化作用的可能。 結果：CIP-A5濃度在5-30ng/ml范圍內,與明膠酶直接孵育30min,明膠酶的激活作用從28.4%增加到126.7%；與HSC-T6細胞接觸24h后,CIP-A5(1-100μ/ml)對培養(yǎng)上清中MMP-2的活性由38.6%提高至190.5%,MMP-9的活性由22.4%增加至170.0%；在與TGF-p共同孵育后,CIP-A5對培養(yǎng)上清中MMP-2的活性由30.0%增加至169.5%,MMP-9的活性由21.4%增加至170.0%；以Western blot分析發(fā)現(xiàn)該化合物對活化的MMP-2的表達量由50%提高到160.8%,MMP-9的表達量也由30.0%增加至109.5%；CIP-A5(1-100μg/ml)經(jīng)過72h共同孵育,TIMP-1的表達抑制率分別為10.6%,32.8%,51.7%,67.3%及79.5%；在與系列濃度的CIP-A5(1-100μg/ml)共同孵育72h后,TGF-β與TNF-α的表達呈劑量依賴性降低,其中TGF-p的表達抑制率從15.7%增加至50%；TNF-α的表達抑制率從32.8%增加至160%；CTGF抑制率分別為15.3%,26.8%,41.5%,68.6%以及79.1%。 結論：化合物CIP-A5能夠抑制由TGF-β誘導的肝星狀細胞的活化和增殖；能夠提高和增強明膠酶活性,降低TIMP-1、TGF-β1、TNF-α、CTGF的表達,從而發(fā)揮抗肝纖維化作用。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R575.2

【參考文獻】

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本文編號：2664635