【摘要】： 研究背景：急性肝衰竭(acute liver failure, ALF)是一種嚴重危害人類生命健康的臨床綜合征,肝移植是目前最有效的治療肝衰竭的方法,但是,肝移植由于供體短缺及費用昂貴等問題限制了其廣泛應用。因此,迫切需要探索新的治療方法以挽救肝衰竭患者的生命。近年來許多動物及臨床研究發(fā)現(xiàn),骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BMSC)可以在體內(nèi)外誘導分化為肝細胞,BMSC移植可以在體內(nèi)增殖、分化為肝細胞或肝樣細胞,替代受損的肝細胞,促進肝功能恢復,因此,有人已將BMSC移植用于治療ALF并顯示出具有顯著的療效。目前,對于BMSC治療肝衰竭作用機制的研究主要集中在BMSC的分化潛能方面。然而實驗研究發(fā)現(xiàn),BMSC在體外誘導分化為肝細胞需要6-12天,體內(nèi)分化也需要4-5天,而BMSC在移植的早期未分化為肝細胞或肝樣細胞時即顯示出具有顯著的療效,用干細胞分化機制不足以解釋BMSC移植的這種早期應答。那么,BMSC移植早期是通過何種機制發(fā)揮作用?有研究提出,BMSC具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用,這種作用是否在BMSC移植早期發(fā)揮其效應?另外,大量臨床研究結(jié)果表明,ALF患者伴有的腸源性內(nèi)毒素血癥(Intestinal Endotoxemia, IETM)在肝衰竭的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用,內(nèi)毒素可以直接損傷肝細胞,還可以激活下游炎癥級聯(lián)反應,引起大量肝細胞凋亡及壞死,導致肝衰竭。韓德五教授提出了IETM是各種原因?qū)е赂嗡ソ甙l(fā)生的唯一的共同物質(zhì)基礎,并且這一理論在實驗和臨床研究中已經(jīng)得以證實。那么：BMSC對ALF大鼠IETM究竟有何作用?其作用機制如何?是本文的研究重點。 本課題首先建立一種簡便、快捷的體外分離培養(yǎng)大鼠BMSC的方法,在此基礎上觀察BMSC移植治療ALF大鼠的作用,從細胞水平及在體水平探討其可能的機制,為臨床治療ALF提供新的思路。 本研究共分三個部分： 第一部分骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)及其生物學特性的研究 第二部分骨髓間充質(zhì)干細胞移植對急性肝衰竭大鼠腸源性內(nèi)毒素血癥的影響 第三部分骨髓間充質(zhì)干細胞移植對急性肝衰竭大鼠腸源性內(nèi)毒素血癥治療作用機制的研究 第一部分骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)及其生物學特性的研究 目的建立一種簡便、快速、有效的體外分離培養(yǎng)大鼠BMSC的方法并進行初步鑒定。 方法無菌條件下取大鼠四肢長骨骨髓,在含20%胎牛血清的DMEM/F12中貼壁培養(yǎng),倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)變化；采用免疫細胞化學方法檢測細胞膜抗原CD34、CD44及CD45的表達；采用流式細胞術(shù)檢測細胞周期；細胞加成脂誘導劑體外培養(yǎng)14天后,行油紅O染色,觀察細胞分化結(jié)果。 結(jié)果分離培養(yǎng)的細胞2-3天后呈多形性貼壁生長并開始大量增殖,3代以后的細胞呈均一的成纖維細胞樣形態(tài)。免疫細胞化學染色顯示,細胞表面分子CD44陽性,CD34、CD45陰性。細胞周期檢測結(jié)果顯示,(80.13±1.24)%的第3代BMSC處于G1期。細胞加成脂誘導劑后14天經(jīng)油紅O染色可見胞質(zhì)內(nèi)有橙紅色的脂滴。 結(jié)論采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法可以方便、快捷地獲得BMSC,并且在體外培養(yǎng)條件下能大量增殖,經(jīng)誘導后可以向脂肪細胞分化,具有干細胞的生物學特性,是一種比較理想的體外培養(yǎng)方法。 第二部分骨髓間充質(zhì)干細胞移植對急性肝衰竭大鼠腸源性內(nèi)毒素血癥的影響 實驗一急性肝衰竭大鼠伴腸源性內(nèi)毒素血癥模型的建立 目的探討用不同劑量硫代乙酰胺(Thioacetamide, TAA)制作ALF大鼠伴IETM模型的量-效關系。 方法設立3個TAA劑量組,每組10只,分別以200、400、600 mg/(kg·d)劑量的TAA灌胃,24h后相同劑量TAA重復灌胃一次,建立不同劑量TAA致大鼠IETM的動物模型,并設立對照組,以等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃。觀察造模后24h、48h大鼠的死亡率,48h后剩余大鼠腹主動脈采血檢測血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)及血漿內(nèi)毒素含量,取部分肝臟及回腸組織作常規(guī)HE染色,光鏡下觀察肝臟及回腸組織的病理變化。 結(jié)果不同劑量TAA組大鼠在肝損傷評分、ALT、AST、內(nèi)毒素水平方面與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。TAA劑量越大,死亡率越高,肝損評分、ALT、AST及內(nèi)毒素水平也越高。200mg/kg TAA模型組肝壞死不明顯,400mg/kg TAA模型組與600mg/kg TAA模型組有明顯肝壞死,ALT、AST及內(nèi)毒素水平與200mg/kg TAA組相比明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。不同劑量TAA模型組有不同程度的腸粘膜損傷。 結(jié)論TAA致肝損傷具有明顯的劑量依賴性,其中400 mg/(kg·d)TAA劑量為制備ALF伴IETM模型的適宜劑量。 實驗二骨髓間充質(zhì)干細胞移植對急性肝衰竭大鼠內(nèi)毒素及細胞因子的影響 目的探討B(tài)MSC移植對TAA所致ALF大鼠內(nèi)毒素及TNF-α、IL-10的影響。 方法雌性Wistar大鼠30只,體重250±10g,隨機分為對照組、TAA模型組和TAA+BMSC治療組,每組10只。采用TAA 400mg/kg灌胃,24h后重復灌胃建立ALF大鼠模型,對照組給予0.9%氯化鈉溶液2m1灌胃；第二次灌胃后將BMSC(1×106個細胞/只)經(jīng)尾靜脈移植到TAA+BMSC治療組大鼠體內(nèi),對照組和TAA模型組大鼠經(jīng)尾靜脈給予等量無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)。BMSC治療72h后將大鼠麻醉狀態(tài)下腹主動脈采血,檢測血清中ALT、AST以及血漿內(nèi)毒素含量,ELISA法檢測血漿及肝組織勻漿中TNF-α、IL-10含量。取部分肝組織及回腸組織作常規(guī)病理檢查。 結(jié)果TAA模型組與對照組比較,大鼠血清ALT、AST、血漿內(nèi)毒素、血漿與肝組織TNF-α、IL-10水平均顯著上升(P0.05), TNF-α/IL-10的比值明顯升高。TAA+BMSC治療組與TAA模型組相比大鼠血清ALT、AST以及血漿內(nèi)毒素水平均顯著降低,血漿與肝組織IL-10水平明顯升高,TNF-α/IL-10的比值明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。TAA+BMSC治療組與對照組相比,血漿與肝組織TNF-α/IL-10的比值無明顯差異(P0.05)。病理切片顯示BMSC能夠明顯減輕TAA對肝組織的損害,TAA模型組及TAA+BMSC治療組回腸組織病理顯示均有不同程度損害。 結(jié)論TAA造模形成的ALF大鼠伴有IETM, BMSC尾靜脈移植對ALF大鼠IETM有一定的保護作用,可以調(diào)節(jié)促炎與抗炎因子達到新的平衡,這可能是BMSC移植治療ALF的作用機制之一。 第三部分骨髓間充質(zhì)干細胞移植對急性肝衰竭大鼠腸源性內(nèi)毒素血癥治療作用機制的研究 實驗一骨髓間充質(zhì)干細胞對脂多糖刺激枯否細胞分泌細胞因子的影響 目的探討在體外條件下BMSC對脂多糖(LPS)刺激后大鼠肝臟枯否細胞(KC)分泌TNF-α的影響。 方法采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離、純化大鼠BMSC,原位灌流、Percoll密度梯度離心法原代分離培養(yǎng)肝KC,取體外培養(yǎng)48h后的KC用于實驗,用LPS(終濃度1μg/ml)刺激KC,BMSC加入KC中建立BMSC共培養(yǎng)體系,實驗分為四組：①KC組；②KC+LPS組；③KC+LPS+BMSC組；④KC+LPS+BMSC培養(yǎng)上清組。LPS作用24h、48h、72h后收集培養(yǎng)上清檢測培養(yǎng)體系中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的水平。 結(jié)果無LPS刺激時,正常肝臟KC培養(yǎng)上清中可檢測到少量TNF-α,經(jīng)LPS刺激后KC培養(yǎng)上清中TNF-α含量明顯上升；而與BMSC共培養(yǎng)時,TNF-α含量顯著減少(P0.05)；KC與BMSC培養(yǎng)上清共培養(yǎng)時,TNF-α含量與②組相比明顯減少,與③組相比TNF-α含量較高,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 結(jié)論BMSC可以抑制LPS刺激后大鼠肝臟KC的活化,減少TNF-α的分泌,BMSC培養(yǎng)上清同樣可以抑制KC的活化,但作用比BMSC弱。 實驗二骨髓間充質(zhì)干細胞移植對急性肝衰竭大鼠CD14、NF-κB的影響 目的觀察BMSC移植對ALF大鼠肝組織中內(nèi)毒素受體CD14及核因子NF-κB表達的影響。 方法30只雌性Wistar大鼠,體重250±10g,隨機分為對照組、TAA模型組和TAA+BMSC治療組,每組10只,BMSC移植治療72h后將各組存活大鼠麻醉,腹主動脈采血后取部分肝組織備檢。SABC免疫組化法檢測肝組織中內(nèi)毒素受體CD14及核因子NF-κB的表達。 結(jié)果對照組肝組織可見少量CD14、NF-κB表達陽性的細胞。TAA模型組與對照組相比,CD14、NF-κB表達明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。經(jīng)BMSC治療后,CD14、NF-κB表達比TAA模型組明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),與對照組相比,BMSC治療組CD14、NF-κB仍然很高,差異也有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 結(jié)論BMSC移植可以抑制肝組織CD14及NF-κB的表達。BMSC移植可能通過抑制內(nèi)毒素受體CD14及核因子NF-κB的表達來阻斷內(nèi)毒素在體內(nèi)發(fā)揮效應。
【圖文】：

表3各組大鼠血清ALT、AST濃度及血漿內(nèi)毒素水平比較(x士s)組別nALT(U/L)AST(U/L)ET(EU/m對照組1047.81士22.6169，33士22.040.103士0.0Zoomg/kgTAA模型組8305.09士116.78八465.58士139.96八0.436士0.0400mg/kgTAA模型組5901.67士274.31‘空、*584.37士250.90‘、*0.550士0.096O0mg/kgTAA模型組2一454.84士473.49△*米1589.23士159.67八*米0.620士0.05:“只0.05，”對照組;女只0.05”Zoomg/kgT從組;冰代0.05叮400mg/kgT從組表4內(nèi)毒素與ALT、AsT的相關性項目r值尸值ALI…AST0.5030.0010.7100.0002500

圖28各組大鼠血槳內(nèi)毒素水平比較討論大量研究表明，各種肝病均伴有不同程度的腸源性內(nèi)毒素血癥(IniestinalEndotoxemia，TM)，而IETM是更為重要的致肝損傷因素Il]，對于IETM的研究一直是基礎與臨床的要課題。建立穩(wěn)定的IETM動物模型則是研究IETM的病理生理以及探討其防治措施的基礎與前題。目前報道較多的1’AA致大鼠ALF模型具有良好的重復性和可行性，而且1人A在引起肝損傷的同時內(nèi)毒素水平升高12一3]，更符合臨床實際，是研究急性肝損傷常用的動物模型。然而，以往所用的TAA劑量從150一600m叭g體重不等，給藥方式有皮下注射、腹腔注射及灌胃等，對所造模型的評價也無統(tǒng)一標準陣8]。本實驗通過給予不同劑量TAA灌胃，觀察動物成模的情況，，摸索一個適宜的造模劑量，為肝損傷伴IETM的防治研究提供實驗基礎。rl人A是一種肝毒性藥物，可激活磷脂酶AZ，使溶血卵磷脂產(chǎn)生增加，破壞肝細胞膜
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R575.3

【引證文獻】

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1 江敏華;間充質(zhì)干細胞的免疫調(diào)控在治療肝衰竭中的作用及機制探討[D];蘇州大學;2011年

本文編號：2656114