【摘要】： 肝纖維化(hepatic fibrosis, HF)是多種致病因子引起慢性肝病,進而發(fā)展為肝硬化的共有病理改變和必經(jīng)途徑。肝星狀細胞(hepatic stellate cells, HSCs)活化、增殖進而合成大量的膠原等細胞外間質(zhì)(extracellular matrix, ECM)成分是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)。因此,抑制HSCs活化、增殖并誘導(dǎo)其凋亡是逆轉(zhuǎn)肝纖維化的關(guān)鍵所在。 黏著斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)是整合素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中連接整合素與下游信號分子的媒介,處于細胞內(nèi)多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的交匯點,能激活多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。FAK被激活后可以調(diào)節(jié)其下游信號分子,引起細胞骨架重組和多種基因表達,如可以通過Ras依賴的絲裂源活化蛋白激酶(Mitogen Activated Protein Kinases, MAPK)途徑引起級聯(lián)反應(yīng),參與細胞鋪展、增殖、分化與凋亡等多種生物學(xué)行為。多項研究表明FAK在成纖維細胞、平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞及多種腫瘤細胞的增殖、凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用,但對HSCs增殖與凋亡的影響知之尚少。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是目前最有效的基因沉默技術(shù),能特異性抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄,進而下調(diào)相應(yīng)蛋白水平及功能。 為此,我們采用RNAi技術(shù),以FAK為切入點,在前期應(yīng)用含U6啟動子及增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)的質(zhì)粒載體pEGFP成功構(gòu)建靶向FAK的短發(fā)卡RNA(shRNA)干擾重組體的基礎(chǔ)上,在陽離子聚合物介導(dǎo)下將干擾質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染HSCs,研究特異性阻斷FAK表達對纖維連接蛋白(fibronectin, FN)刺激的HSCs增殖與凋亡的影響及其機制。 目的:采用RNAi技術(shù),探討FAK shRNA對HSCs增殖、凋亡的影響以及FAK介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、bcl-2、bax在HSCs增殖與凋亡中的作用。 方法:體外培養(yǎng)HSCs,并以FN刺激HSCs增殖,在陽離子聚合物梭華-sofast~(TM)介導(dǎo)下,應(yīng)用FAK shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠肝星狀細胞系HSC-T6。實驗分5組:①空白對照組(簡寫為Con組);②FN刺激組(簡寫為FN組);③轉(zhuǎn)染試劑組(簡寫為sofast組);④pEGFP-HK shRNA組(簡寫為HK組);⑤pEGFP-FAK shRNA組(簡寫為FAK shRNA組);②～⑤組中FN濃度均為10μg·mL~(-1)。 采用MTT法測定HSCs增殖;流式細胞術(shù)(flow cytometry, FCM)、末段脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧三磷酸尿苷缺口末段標(biāo)記(terminal deoxynucleotidy1 transferase-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)法與透射電鏡技術(shù)檢測HSCs的凋亡;采用Western blot及real-time Q-PCR等實驗方法,檢測FAK、ERK1、bcl-2、bax與caspase-3蛋白及其mRNA表達;Western blot實驗方法檢測轉(zhuǎn)染前后p-FAK、p-ERK蛋白表達情況。 結(jié)果:①FAK shRNA抑制FAK mRNA表達:real-time Q-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后FN組FAK mRNA表達較Con組升高57.00%,P0.01,但與sofast組、HK組之間無顯著性差異;FAK shRNA組FAK mRNA表達水平較HK組顯著下降,P0.01,且最高下調(diào)率為76.73%,出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后24 h;②FAKshRNA抑制FAK表達及活化:Western blot結(jié)果顯示,FN刺激后HSCs FAK的蛋白表達量較Con組升高49.70%,P0.01,但與sofast組、HK組比較無明顯差異,P0.05;FAK shRNA組FAK蛋白表達量較HK組顯著降低,P0.01,且最高下調(diào)率為72.53%,出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后48 h。p-FAK(Tyr~(397))蛋白表達亦表現(xiàn)出相似的變化:FAK shRNA組p-FAK(Tyr~(397))蛋白較HK組顯著下降,P0.01,且最高下調(diào)率出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后48 h,與FAK蛋白的表達水平變化一致,表明FAK shRNA干預(yù)HSCs可明顯抑制FAK磷酸化;③FAK shRNA抑制ERK1 mRNA表達:real-time Q-PCR結(jié)果顯示,FAK shRNA組ERK1 mRNA表達較HK組顯著下降,P0.01,且最高下調(diào)率為55.67%,出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后48 h;④FAK shRNA抑制ERK_1表達及活化:Western blot顯示FN刺激后HSCs的ERK_1蛋白表達量較Con組升高77.55%,P0.01,但與sofast組、HK組比較無明顯差異;FAK shRNA組ERK_1蛋白表達量顯著降低,較HK組下降了65.13%,P0.01。同時,p-ERK)1的變化也表現(xiàn)出相似的趨勢,其最高下調(diào)率為75.47%,出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后72 h;⑤FAK shRNA抑制HSCs增殖:在96孔板內(nèi)轉(zhuǎn)染FAK shRNA質(zhì)粒,采用MTT方法檢測顯示,FAK shRNA組與HK組相比,對HSCs增殖有顯著抑制作用,質(zhì)粒轉(zhuǎn)染12 h、24 h、48 h后增殖抑制率分別為11.08%、15.12%、28.62%,呈時間依賴性關(guān)系;⑥FAK shRNA促進HSCs凋亡:FAK shRNA轉(zhuǎn)染HSCs 24 h后,采用FCM檢測HSCs凋亡,結(jié)果顯示:FN組HSCs凋亡率較Con組降低48.73%,P0.01,但與sofast組、HK組之間無明顯差異;FAK shRNA組HSCs凋亡率較HK組明顯增高(8.29%±0.79% vs 2.70%±0.31%),P0.01。同時采用TUNEL法顯示:FN組HSCs凋亡率較Con組降低52.01%,P0.01,但與sofast組、HK組之間無明顯差異;FAK shRNA組HSCs凋亡率較HK組明顯增高(19.00%±0.92% vs 7.63%±0.70%),P0.01。透射電鏡可觀察到FAK shRNA組中大量的HSCs細胞膜皺縮,胞漿濃縮,核染色質(zhì)凝集、固縮,聚集于核膜下呈境界分明的團塊狀、花瓣狀或新月體形,有的可見核碎裂及凋亡小體形成;⑦caspase-3表達增強:real-time Q-PCR結(jié)果顯示,FN組caspase-3 mRNA表達較Con組降低35.00%,P0.05,但與sofast組、HK組之間無明顯差異;FAK shRNA組caspase-3 mRNA表達較HK組明顯升高,P0.01,且最高上調(diào)率為60.71%,出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后36 h。Western blot顯示FN刺激后HSCs caspase-3蛋白表達量較Con組降低20.87%,P0.05,但與sofast組、HK組比較無明顯差異;FAK shRNA組caspase-3蛋白表達量較HK組顯著升高,P0.01,且最高上調(diào)率為75.29%,出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后48 h;⑧bcl-2/bax比值降低:real-time Q-PCR結(jié)果顯示,FN組bax mRNA表達較Con組降低33.00%,P0.01,但與sofast組、HK組之間無明顯差異;FAK shRNA組bax mRNA表達較HK組明顯升高,P0.01,且最高上調(diào)率為65.82%,出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后36 h。Western blot顯示FN刺激后HSCs的bax蛋白表達量較Con組降低19.08%,P0.01,但與sofast組、HK組比較無明顯差異,FAK shRNA組bax蛋白表達量較HK組顯著升高,P0.01,且最高上調(diào)率為66.06%,出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后48 h。real-time Q-PCR結(jié)果顯示,FN組bcl-2 mRNA表達較Con組升高35.00%,P0.01,但與sofast組、HK組之間無明顯差異;FAK shRNA組bcl-2 mRNA表達較HK組明顯降低,P0.01,且最高下調(diào)率為48.03%,出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后36 h。Western blot顯示FN刺激后HSCs bcl-2蛋白表達量較Con組升高69.53%,P0.01,但與sofast組、HK組比較無明顯差異;FAK shRNA組bcl-2蛋白表達量較HK組顯著降低,P0.01,且最高下調(diào)率為71.90%,出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后48 h。分別把各組中bcl-2、bax翻譯和轉(zhuǎn)錄水平的表達作一比值,可見在翻譯水平和轉(zhuǎn)錄水平,FAK shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HSCs后降低了bcl-2/bax比值。 結(jié)論:在陽離子聚合物介導(dǎo)下瞬時轉(zhuǎn)染靶向FAK的shRNA質(zhì)粒,可在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平下調(diào)FAK表達,伴隨FAK活性的下降,ERK1的表達亦表現(xiàn)出相似的變化,并可以呈時間依賴性地抑制FN刺激的HSCs增殖,此可能與抑制FAK-ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān);可以誘導(dǎo)FN刺激的HSCs發(fā)生凋亡,并在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平檢測到caspase-3表達增強,此可能與抑制FAK-ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和/或下調(diào)bcl-2/bax比值有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R575.2

【參考文獻】

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本文編號：2655720