【摘要】：研究背景 生物體在從器官、組織到細胞等各個層次上的生命活動均離不開一定的力學環(huán)境。作為生命基本組成單元的細胞,其生存的力學環(huán)境非常復雜。肝星狀細胞(hepatic stellate cells, HSC)是肝臟分泌細胞外基質(zhì)的主要細胞,在肝纖維化的發(fā)病機制中占有重要的地位。如何控制HSC的活性從而逆轉(zhuǎn)肝纖維化的進程是抗肝纖維化研究的重點之一。慢性肝炎往往伴隨著門脈高壓癥,高門脈壓力會使肝竇擴張,HSC受到的牽張力增大。國內(nèi)外對機械牽張對HSC生物性狀的影響的研究甚少。本研究通過應用程序化細胞牽拉裝置Flexercell Strain Unit 2000,對體外培養(yǎng)的HSC施與循環(huán)機械牽拉造成周期性張應變,并研究其對HSC生物學活性的影響,探討張應變在HSC活化、增殖、生成ECM等功能改變中所起的作用及其作用機制。 方法 采用酶消化—密度梯度離心法分離大鼠HSC。實驗分為對照Control組(Con)、單純牽拉Stretch組(MS)、牽拉+ cRGDfV (AM100)組(AM)、牽拉+SB202190組(SB)、牽拉+wortmannin組(wort)、牽拉+ PD98059組(PD)共六組。細胞培養(yǎng)于BioFlex六孔板,生長至合適密度后,換成含1% FBS的DMEM培養(yǎng)液同步化24小時,含抑制劑的四組細胞用含相應工作濃度的抑制劑工作液處理,對照組與單純牽拉組細胞用含0.5‰DMSO和1% BSA的DMEM培養(yǎng)液處理;1小時后給除對照組外的其他組細胞施加周期性張應變(牽拉條件為10%幅度,0.5 Hz頻率,24 h時間)。牽拉完畢后檢測細胞的增殖、遷移等功能,提取總RNA行PCR檢測各種細胞活化相關因子的基因表達,提取總蛋白行western blot檢測多種信號蛋白表達。實驗重復三次。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示,應用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析,方法采用單因素方差分析,顯著性P0.05認為總體差異有統(tǒng)計學意義,多重比較選用Tukey檢驗。 結果 一、HSC的分離與鑒定:應用密度梯度離心法成功分離出靜止期大鼠HSC,臺盼藍染色鑒定HSC存活率95%以上; Desmin、α-SMA免疫熒光鑒定靜止與活化HSC細胞純度達95%以上。細胞正常培養(yǎng)5-7天左右自行活化,生長繁殖明顯增強,傳代培養(yǎng)5次后生長繁殖能力下降。 二、不同牽拉條件對HSC的影響 當牽拉參數(shù)設置為10%幅度、0.5 Hz頻率、24小時的時候,牽拉組HSC的膠原基因生成不僅比對照組顯著增加,也是各種條件中差異比較明顯而穩(wěn)定的一個狀態(tài)。故后續(xù)實驗中均使用10%幅度、0.5赫茲、24小時的牽拉條件。 三、周期性張應變對HSC生物活性的影響 周期性張應變能顯著促進HSC增殖,給予整合素αvβ3抑制劑cRGDfV能夠抑制周期性張應變的促增殖效應。周期性張應變明顯促進了HSC的α-SMA的表達,同時也促進TGF-beta 1與CTGF等促纖維化因子的表達,提示周期性張應變促進HSC的增殖與活化,是部分通過促進TGF-β1與CTGF表達實現(xiàn)的。另外本實驗未能檢測到周期性張應變影響PDGF-B及其受體PDGFR-B表達,提示周期性張應變的促增殖活化作用與PDGF-B通路無關。周期性張應變能夠顯著促進HSC的I型膠原α1鏈(COL1A1)和III型膠原α1鏈(COL3A1)的mRNA表達,其中以COL3A1更為明顯;該作用能夠被cRGDfV所抑制。通過劃痕與Transwell實驗發(fā)現(xiàn),周期性張應變單獨作用對HSC的遷移影響不明顯,但是能夠增強PDGF所誘導的HSC遷移。而通過抑制αvβ3整合素的活化,周期性張應變的促增殖、活化與遷移影響明顯減弱。綜合前述結果,本部分研究發(fā)現(xiàn)提示在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中,一方面直接通過整合素途徑,促進TGF-beta、CTGF等促纖維化因子,促使HSC的增殖活化,從而直接參與了肝纖維化的發(fā)生;另一方面,通過激活整合素途徑,協(xié)同細胞因子PDGF增強HSC的遷移能力,加快肝纖維化的進展。肝硬化門脈高壓癥引起HSC受到的張應變增加,而張應變通過促進HSC的纖維生成作用而反饋加重門脈高壓,提示張應變對門脈高壓癥狀的維持和發(fā)展可能起到一定的作用。 四、周期性張應變調(diào)節(jié)HSC功能的機制研究 結果說明周期性張應變能夠明顯增強整合素β3、p38、Akt、ERK1/2的磷酸化。cRGDfV不能抑制HSC的整合素β3亞基磷酸化,但能抑制細胞內(nèi)粘附斑激酶FAK的磷酸化水平。Akt、p38、ERK1/2磷酸化抑制劑wortmannin、SB202190、PD98059分別能夠明顯降低HSC相應蛋白磷酸化水平。周期性張應變能夠明顯增強HSC增殖蛋白PCNA的表達,并促進α-SMA、COL1A1和COL3A1的基因表達;應用cRGDfV或能夠明顯抑制張應變的這些促增殖活化效應;而應用SB202190,Wortmannin ,PD98059能夠部分抑制張應變的這些效應。這些結果提示周期性張應變對HSC的影響是通過激活整合素αvβ3,活化FAK這條信號轉(zhuǎn)導途徑實現(xiàn)的;而αvβ3,FAK之后的通路可能與MAPK和Akt通路相關。 結論 1、成功在體外分離出大鼠靜止HSC,分離出的靜止HSC能夠傳代培養(yǎng)多次并在培養(yǎng)過程中自行活化。 2、周期性張應變能明顯促進HSC的I型膠原α1鏈的基因表達,特別是在牽拉幅度為10%,牽拉頻率為0.5 Hz,牽拉時間為24小時的牽拉條件下促進效果最顯著。 3、周期性張應變能明顯促進HSC的增殖和活化,并促進了PDGF-BB介導下的HSC遷移,提示張應變能夠增強HSC的促纖維化效應。 4、周期性張應變能促進HSC胞膜上的整合素αvβ3的表達和活化,致FAK磷酸化,激活MAPK、Akt等信號轉(zhuǎn)導通路,導致后續(xù)生物學效應。提示整合素αvβ3是周期性張應變作用于HSC的重要信號分子。
【圖文】：

A 原代分離 HSC (10×) B HSC-T6 (10×)圖 2 大鼠原代分離 HSC 與細胞株 HSC-T6 對比A Desmin B Hoechst C Merge圖3 靜息大鼠HSC Desmin免疫熒光染色（40×）

周期性張應變對肝星狀細胞生物活性的材 料 與 方 法一、 主要儀器與試劑（一）主要儀器設備紫外分光光度計： 德國Eppendorf公司普通PCR儀，熒光PCR儀，水平型電泳儀，凝膠成像分析系統(tǒng)： 美國Bio-Rad公司其余同第一部分。(二) 張應變施加系統(tǒng)9期 余幫：周期性張應變對肝星狀細胞生物活性的影響 E
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R575.2

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本文編號：2653097