發(fā)布時間：2020-04-29 11:11

【摘要】：一、研究背景肝臟各種良惡性疾病常引起肝功能不同程度的損傷。特別在肝臟惡性腫瘤的手術治療中,肝功能衰竭是患者術后死亡的一大原因,也是制約晚期肝癌患者進行手術治療的難點之一。目前對于肝功能衰竭的治療常用方法有非生物型人工肝支持治療及肝移植,但這些技術仍存在諸多局限性,不能很好地解決術后肝功能衰竭的問題。而過去研究發(fā)現(xiàn)肝臟是一個具有強大的再生能力的器官,在部分肝切除術(partial hepatectomy,PH)后,肝臟能在較短期內(nèi)通過自身的修復完全恢復自身體積和功能~([1]),因此人為調(diào)控肝臟再生使得肝臟恢復原有功能可作為一種治療肝功能衰竭的有效手段。對于肝臟外科,若能有效調(diào)控肝臟再生,既可避免肝切除術后可能出現(xiàn)的肝功能衰竭問題,又可拓寬肝切除術的適應癥,為肝臟疾病的治療提供強有力的支持。因此,深入研究肝臟再生過程中肝細胞增殖機制及肝再生調(diào)控網(wǎng)絡的作用是必不可少的�？缒ず头核貥咏Y構域蛋白1(Tmub1),也被稱為肝細胞臨時穿梭蛋白(HOPS),是一個核質(zhì)穿梭蛋白,包含一個泛素樣結構域、一個出核信號和脯氨酸富集區(qū)~([2])。在肝再生過程的不同時間,Tmub1蛋白大量表達,并改變亞細胞定位,抑制肝細胞增殖~([3])。有文獻報道,在肝細胞增殖過程中,轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ可增強Tmub1的表達~([3]);Tmub1沉默后導致中心體功能異常,引起細胞分裂失敗和細胞周期阻滯~([4]),提示Tmub1可影響細胞周期進程~([5])。Tmub1參加了肝再生調(diào)控網(wǎng)絡,但Tmub1在肝再生調(diào)控網(wǎng)絡中起的作用及Tmub1對細胞增殖的影響機制尚未闡明。二、研究目的1.通過構建小鼠70%肝切除模型,并向小鼠轉(zhuǎn)染異位表達Tmub1質(zhì)粒,在體內(nèi)層面明確Tmub1對肝再生和肝細胞增殖的影響。2.使用人正常肝細胞L02,明確Tmub1通過抑制STAT3磷酸化對肝細胞增殖的影響。3.探討Tmub1與STAT3的相互作用機制。三、材料和方法1.構建小鼠70%肝切除再生模型,并分別于術前2天、術后1天通過尾靜脈向小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)染Tmub1過表達質(zhì)粒及陰性對照質(zhì)粒,并設立假手術組(不行肝切除術,僅開腹并游離肝周韌帶)。通過檢測術后3天小鼠肝重/體重、血清AST/ALT水平,評估各組小鼠肝切除術后肝再生情況,使用Western Blotting技術檢測增殖相關蛋白表達情況,并采用免疫組化和HE染色分析各組小鼠肝損傷情況和肝細胞增殖情況,明確Tmub1對小鼠肝再生的影響以及對STAT3通路相關蛋白表達量的影響。2.使用人Tmub1過表達質(zhì)粒及shRNA,瞬時轉(zhuǎn)染人正常肝細胞L02后通過EdU檢測Tmub1異位表達對L02細胞增殖能力的影響,WB檢測Tmub1異位表達對STAT3通路相關蛋白表達的影響,免疫熒光和WB檢測Tmub1異位表達對STAT3和p-STAT3亞細胞定位的影響。3.通過相應Rescue實驗,觀察STAT3抑制劑stattic/激動劑OSM對Tmub1誘導的肝細胞增殖能力的逆轉(zhuǎn)作用。4.通過生物信息學分析、染色質(zhì)免疫沉淀技術(ChIP)及熒光素酶報告基因?qū)嶒?Luciferase reporter gene assay)探討STAT3對Tmub1表達的誘導作用,通過免疫共沉淀實驗明確Tmub1與STAT3蛋白的相互作用。5.實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析;計量資料結果以均數(shù)±標準差表示,兩組間均數(shù)采用t檢驗進行比較。P0.05作為顯著統(tǒng)計學差異的標準。四、結果1.在肝切除術后3天,過表達Tmub1的小鼠肝重/體重比顯著低于陰性對照組及空白組小鼠,提示過表達Tmub1延緩了小鼠肝臟再生;血清轉(zhuǎn)氨酶檢測提示過表達Tmub1組小鼠血清ALT、AST水平顯著高于對照組,提示肝功能恢復情況差;同時,免疫組化及HE染色示Tmub1過表達組小鼠肝細胞損傷更為嚴重,且增殖指標Ki-67、p-H3陽性率顯著低于陰性對照組及空白組小鼠;進一步的Western Blotting結果提示STAT3磷酸化水平及MCM2、Cyclin D1的表達量在過表達Tmub1小鼠中明顯降低,提示Tmub1顯著抑制了肝再生過程中的肝細胞增殖。2.Western Blotting提示過表達Tmub1顯著降低STAT3磷酸化水平及cyclin D1和c-myc的表達量而不影響STAT3總蛋白水平;反之干擾Tmub1表達后,STAT3磷酸化水平及cyclin D1和c-myc的表達量顯著增高,但總STAT3表達量不變。免疫熒光提示Tmub1不影響STAT3的亞細胞定位。3.EdU細胞增殖實驗提示,過表達Tmub1的人正常肝細胞L02增殖受到顯著抑制,但在加入STAT3激動劑OSM后細胞增殖情況恢復;干擾Tmub1表達可顯著促進L02細胞增殖,而該效應可被STAT3抑制劑stattic所回復。Western Blotting結果同樣提示過表達Tmub1引起STAT3磷酸化水平及cyclin D1和c-myc的表達量降低,可在加入OSM之后恢復。反之亦然。4.生物信息學分析發(fā)現(xiàn)人的Tmub1基因啟動子區(qū)域存在一個STAT3的結合位點。染色質(zhì)免疫沉淀技術(ChIP)及熒光素酶報告基因?qū)嶒?Luciferase reporter gene assay)提示STAT3可與Tmub1啟動子相結合,并提高Tmub1啟動子的活性、增強Tmub1的表達。5.利用免疫共沉淀技術(co-IP),我們發(fā)現(xiàn)Tmub1與STAT3可形成蛋白質(zhì)復合物。五、結論Tmub1是一個肝再生的負相調(diào)控因子。STAT3可誘導Tmub1的基因表達,而Tmub1又可通過結合并抑制STAT3的磷酸化激活來發(fā)揮其對肝細胞增殖的抑制作用。Tmub1和STAT3可能形成了一個肝細胞增殖過程中的負反饋調(diào)控環(huán)路來調(diào)控肝再生的進程。
【圖文】：

陸軍軍醫(yī)大學碩士學位論文18圖2.1 過表達Tmub1抑制小鼠肝切除術后肝臟再生。A：體內(nèi)轉(zhuǎn)染及肝部分切除術（PH）實驗計劃示意圖；B: 在PH后3天后，Tmub1過表達組和陰性對照組小鼠肝體重比。以假手術組小鼠為對照；C：PH3天后，血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）及谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）水平。*：p < 0.05；**：p <0.01；***：p < 0.001。n=3。2.3.2 過表達 Tmub1 抑制增殖相關蛋白的表達我們將 PH 后 0 時及 3 天獲得的再生肝組織進行 Western Blotting 檢測及組織學分析。與對照組相比，通過體內(nèi)轉(zhuǎn)染過表達 Tmub1 質(zhì)粒，，成功使小鼠肝臟內(nèi) Tmub1 表達量增加，過表達效果滿意。而增殖相關蛋白，如微小染色體維持蛋白（MCM2）、磷酸化信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活子 3（p-STAT3）、細胞周期蛋白 D1(cyclin D1)表達量降低（圖 2.2）。由此可知，Tmub1 在體內(nèi)抑制小鼠肝臟再生。

2.2 A：PH后0h和72h肝組織中Tmub1及增殖相關蛋白的Western blotting分析。B：g結果的灰度值統(tǒng)計圖。**：p < 0.01；*** p < 0.001。n=3。.3.3 組織學分析提示過表達Tmub1組小鼠的增殖水平明顯低于對照組織學分析也得到同樣的結論，Tmub1 抑制了肝細胞的增殖。在 HE 染色Tmub1 組可見更多的退化肝細胞(肝細胞內(nèi)脂質(zhì)異常滯留)，Ki-67 免疫組 Tmub1 組的增殖水平明顯低于對照組（圖 2.3）。
【學位授予單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R575

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1 解景東;楊寶山;;肝再生機制研究現(xiàn)況[J];肝臟;2014年12期

2 李瀚e

本文編號：2644512