【摘要】：【背景】腸易激綜合征(Irritable bowel syndrome,IBS)是以慢性反復發(fā)作腹痛以及排便習慣的改變?yōu)樘卣鞯墓δ苄晕改c道疾病,臨床檢查無明顯器質性改變。盡管是一種較為常見的腸道疾病,它對患者的生活質量以及工作造成了嚴重的影響。IBS的病生理學機制目前仍未完全明確,普遍認為內臟高敏感是其主要的發(fā)病機制之一。5-HT(5-hydroxytryptamine)與IBS患者內臟高敏感密切相關,5-HT受體拮抗劑以及三環(huán)類抗抑郁藥對IBS的治療作用提示中樞5-HT系統(tǒng)在IBS內臟感覺過敏發(fā)病機制中起重要作用。有研究報道,母嬰分離內臟高敏感大鼠結直腸擴張后中縫背核(dorsal raphe nucleus,DRN)5-HT能神經元激活數目較正常對照組明顯增加,電針可以通過降低中縫背核5-HT神經元的高表達而減輕母嬰分離大鼠內臟高敏感性,提示中縫背核5-HT神經元在內臟疼痛調控中有很重要的作用。Nesfatin-1是由核組蛋白2(nucleobindin 2,NUCB2)裂解后產生的一種厭食肽。除了具有抑制攝食作用外,我們的前期研究還發(fā)現nesfatin-1與內臟高敏感有關。Nesfatin-1在中縫背核與5-HT共表達,母嬰分離大鼠通過中縫背核5-HT高表達導致內臟高敏感,側腦室注射nesfatin-1可以激活中縫背核5-HT能神經元,因此我們推測中縫背核nesfatin-1可能通過激活5-HT途徑增加內臟高敏感。本研究采用新生期母嬰分離大鼠內臟高敏感模型,中縫背核5-HT及色氨酸羥化酶(tryptophan hydroxylase,TPH,5-HT合成限速酶)免疫陽性神經元代表中縫背核5-HT神經元,初步探討中縫背核的nesfatin-1對大鼠內臟敏感性的影響及可能的機制�！狙芯磕康摹坎捎眯律谀笅敕蛛x方法來建立大鼠的內臟高敏感模型,初步探討中縫背核nesfatin-1對大鼠內臟敏感性的影響及可能的機制。【方法】1.新生雄性SD大鼠被隨機分成母嬰分離組和正常對照組,從出生后的第2-21天,母嬰分離組組大鼠每天將其與母鼠分開3h,具體操作方法如下:每天早上8:00到11:00之間,將幼鼠從其母鼠籠中取出,置于另外一個鼠籠中,并將該鼠籠放在另外一個房間,使其與母鼠分離,其余時間幼鼠與母鼠共籠飼養(yǎng)。而正常對照組大鼠不與母鼠分離。在出生后第3周和第8周分別觀察兩組大鼠體質量的變化情況。2.通過檢測大鼠在不同結直腸擴張壓力(20 mmHg、40 mmHg、60 mmHg和80mmHg)刺激下的腹壁撤退反射(abdominal withdrawal reflex,AWR)評分和腹外斜肌肌電圖(electromyographic,EMG)曲線下面積(area under the curve,AUC)來評估大鼠的內臟敏感性。3.出生8周時觀察母嬰分離組和正常對照組大鼠在不同強度結直腸擴張壓力刺激時的AWR評分和腹外斜肌EMG曲線下面積,然后用免疫組化方法比較兩組大鼠中縫背核nesfatin-1/NUCB2以及TPH的表達。4.取母嬰分離大鼠隨機分成2組,分別給予抗nesfatin-1/NUCB2抗體或溶劑對照中縫背核內注射,2h后分別檢測該2組大鼠在結直腸擴張刺激時AWR評分和EMG曲線下面積,然后用免疫組化方法比較2組大鼠中縫背核5-HT以及TPH的表達情況。5.取正常大鼠隨機分成2組,分別給予nesfatin-1或溶劑對照中縫背核內注射,連續(xù)注射7天,第7天時觀察2組大鼠在結直腸擴張刺激時的AWR評分和EMG曲線下面積,然后用免疫組化方法比較2組大鼠中縫背核5-HT以及TPH的表達情況。【結果】1.母嬰分離組大鼠在出生后第3周時的體重和正常對照組無明顯差別(P0.05),而出生后第8周時的體重則要明顯低于正常對照組大鼠,兩者之間的差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.在結直腸擴張壓力分別為40、60和80mmHg時,母嬰分離組大鼠的AWR評分以及EMG曲線下面積均明顯高于正常對照組(P0.05)。3.母嬰分離組大鼠中縫背核中nesfatin-1/NUCB2及TPH免疫反應陽性細胞數均明顯高于正常對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.母嬰分離大鼠中縫背核內注射抗nesfatin-1/NUCB2抗體后,在結直腸擴張壓力為40、60和80mmHg時的AWR評分及各個壓力下的EMG曲線下面積均明顯低于溶劑對照組(P0.05),并且中縫背核中5-HT和TPH免疫反應陽性神經元的數量也明顯下降(P0.05)。5.正常對照大鼠中縫背核內注射nesfatin-1后,在結直腸擴張壓力為40、60和80mmHg時的AWR評分和EMG曲線下面積均明顯高于溶劑對照組(P0.05);并且中縫背核中5-HT及TPH免疫反應陽性神經元的數量也顯著增加(P0.05)。【結論】中縫背核nesfatin-1參與了大鼠內臟高敏感的發(fā)生,潛在機制可能與激活中縫背核5-HT能神經元有關。
【圖文】：

用濃度為 10%的水合氯醛（0.3ml/100g wt，IP）麻醉大鼠，進行 DRN 核團內微注射導管埋置術。將大鼠頭部置于腦立體定位儀上，通過調節(jié)門齒桿和耳桿使顱骨保持平行；將大鼠頭部的部分毛發(fā)剃除，頭部皮膚經碘伏消毒后酒精脫碘，用經過高壓消毒的眼科手術剪輕輕剪開大鼠頭部皮膚，呈長約 1.5cm 矢狀切口，棉簽逐層分離皮下組織到達顱骨膜；用蘸有少量雙氧水的棉簽輕輕涂抹顱骨表面，暴露出前囟（Bregma）及人字點，在立體定位儀引導下 DRN 核團內置入微注射導管，坐標參照 George Paxinos＆Charles Watson 大鼠腦立體定位圖譜第五版【58】，DRN 坐標：前囟（Bregma）后 8mm；左側/右側 0mm；深度為5.8mm。用顱骨鉆在導管的前方兩側分別鉆兩個小孔，使兩個小孔和導管之間構成一個三角形，注意鉆孔時動作要輕柔避免傷及腦實質，孔徑不宜過大，將兩枚不銹鋼螺絲釘置于小孔內，然后用牙科水泥覆蓋以固定導管。手術結束后分別對大鼠進行編號，置于單獨的鼠籠中以避免相互破壞手術部位，手術后大鼠恢復一周。

圖 2 微注射導管位于中縫背核內 （Aq：中腦導水管； DRN：中縫背核）數據統(tǒng)計驗數據采用 SPSS24.0 軟件進行統(tǒng)計分析處理，所有的實驗數據均采用準差（Mean±SD）來表示，結直腸擴張后內臟敏感性（包括大鼠測得的 以及腹外斜肌 EMG 曲線下面積）采用雙因素重復測量方差分析進行統(tǒng)若有差異，，則用 Bonferroni 事后檢定進行兩兩比較。中縫背核免疫陽性量的比較則運用獨立樣本的 t 檢驗，P <0.05 認為各組間的差異有統(tǒng)計
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R574

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本文編號：2643273