【摘要】：研究背景與目的 Syndecan-1(Sdc-1)也叫CD138,是細(xì)胞表面乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)分子,多表達(dá)于成熟上皮細(xì)胞表面,是細(xì)胞間質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)膜的重要組成部分。它由跨膜的核心蛋白和連接于核心蛋白上的硫酸乙酰肝素(HS)鏈及硫酸軟骨素(CS)鏈組成。它是腸屏障的組成部分,阻止致炎因素作用于腸道。完整的HS鏈?zhǔn)荢yndecan-1發(fā)揮作用的主要部分,能與細(xì)胞因子、生長因子、趨化因子、細(xì)胞外基質(zhì)等結(jié)合,在維持細(xì)胞形態(tài)、促進(jìn)組織修復(fù)、調(diào)節(jié)免疫功能中起重要作用。Syndecan-1能與炎癥中的眾多粘附分子、細(xì)胞、趨化因子等結(jié)合,在炎癥細(xì)胞的移動、粘附、活化等過程中發(fā)揮作用。已發(fā)現(xiàn)一些細(xì)菌毒力因子可通過促進(jìn)Syndecan-1的胞外段脫落來增強(qiáng)對宿主的損傷,抑制Syndecan-1脫落可有效抑制細(xì)菌感染造成的肺部炎癥[3]aSyndecan-1胞外段脫落的分子機(jī)制及其調(diào)控尚不清楚,目前認(rèn)為Syndecan-1脫落由金屬蛋白酶介導(dǎo),多種基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)包括MMP-7、 MMP-9、 MMP-14及ADAM17等能在體外切割Syndecan-1使其釋放胞外段[4-5]。近期研究發(fā)現(xiàn),Syndecan-1的編碼基因丙氨酸(第243位)、絲氨酸(第244位)是胞外段裂解靶點(diǎn)之一。改變這2個脫落位點(diǎn)可改變其脫落的特性。 近年來,Syndecan-1胞外段脫落與消化道炎癥的關(guān)系逐漸受到重視。Syndecan-1胞外段的大量破壞、脫落可激發(fā)了促炎與抑炎因子的失調(diào),促使炎癥細(xì)胞的活化、外滲并延緩了消化道黏膜上皮的再生修復(fù)。炎癥性腸病(IBD)是一組腸道慢性非特異性炎性病變,病因未明,目前認(rèn)為與遺傳、環(huán)境因素及腸粘膜免疫異常有關(guān)。IBD在我國的發(fā)病率逐年增高,對其發(fā)病機(jī)制的探索一直是近年來的研究重點(diǎn)。我們既往的研究發(fā)現(xiàn),葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎病情與腸黏膜Syndecan-1蛋白水平減低程度呈顯著的正相關(guān)。 NF-κB是重要的核轉(zhuǎn)錄因子之一,它通過調(diào)控多種基因的表達(dá)而參與免疫反應(yīng)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和腫瘤發(fā)生等過程。靜息狀態(tài)下,抑制蛋白IκB(inhibitor of NF-κB)使之處于非活化狀態(tài),IκB可在內(nèi)毒素、TNF-α、 IL-1β、細(xì)菌、病毒等的刺激下迅速水解,使得NF-κB (P50/P65異源二聚體)激活并進(jìn)入細(xì)胞核,從而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),其中P50與DNA結(jié)合有關(guān),P65含有轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域,負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄激活。NF-κB在炎癥的發(fā)生和持續(xù)中扮演著摘要的角色,抑制其活性可以減緩IBD的炎癥進(jìn)程。 腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factor alpha, TNF-a)是機(jī)體在感染、休克、創(chuàng)傷中引起細(xì)胞、組織損傷的最重要的炎性介質(zhì)之一,腸道大量的細(xì)菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素可刺激TNF-α的合成和釋放。研究證實(shí)在IBD患者糞便中TNF-α的濃度與結(jié)腸炎癥的嚴(yán)重程度相關(guān)。TNF-α可促進(jìn)核因子NF-κB進(jìn)一步活化,同時使炎性因子IL-1p等表達(dá)增加,使炎癥過程得以持續(xù)和放大。白介素-1β(interleukin-lβ, IL-1β)是一種強(qiáng)有力的前炎癥細(xì)胞因子,在個體對多種抗原的侵入反應(yīng)中發(fā)揮作用,它可以提高個體對各種內(nèi)源性及外源性刺激的免疫力。IL-1p在與其它炎癥因子如IL-6等協(xié)同作用時對炎癥的影響會更為明顯。IL-1β在腸道炎癥時能引起粘膜屏障功能下降也已經(jīng)受到人們重視。 有研究報(bào)道中性粒細(xì)胞通過微血管循環(huán)進(jìn)入結(jié)腸黏膜內(nèi),并持續(xù)存在于活動性UC的全過程。固有膜中的中性粒細(xì)胞被認(rèn)為是病理學(xué)炎癥反應(yīng)的可靠標(biāo)志物,中性粒細(xì)胞趨化因子(cytokine-induced neutrophil chemoattractant-1CINC-1)的作用不可忽視。Syndecan-1能與趨化因子KC等結(jié)合,形成趨化因子濃度梯度,趨化中性粒細(xì)胞向炎癥部位游走。Syndecan-1還可結(jié)合于CC趨化因子,抑制該因子介導(dǎo)的T細(xì)胞遷移和Th2細(xì)胞積聚[10]。 鑒于Syndecan-1在腸道炎癥IBD發(fā)病中的重要作用。目前對Syndecan-1基因載體及其不脫落突變體均罕見報(bào)道,且它們與NF-κB信號通路及炎癥因子之間的作用尚未明確。阻礙了對Syndecan-1在胃腸道疾病中具體作用的深入研究。本研究通過建立小鼠Syndecan-1的pcDNA3.0正常高表達(dá)和不脫落真核表達(dá)載體,并驗(yàn)證其在IEC-6、 Caco-2細(xì)胞中的表達(dá),檢測LPS刺激后不同Syndecan-1表達(dá)水平的兩種細(xì)胞在NF-κB信號通路及TNF-α、 IL-1β、 CINC-1的表達(dá)水平變化。進(jìn)一步探討Syndecan-1脫落在腸道炎癥中的作用機(jī)制。 方法 1.從小鼠腸道組織中提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后作為模板,用PCR法擴(kuò)增出syndecan-1分子編碼序列的cDNA全長,與pcDNA3.0載體連接,構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.0-wildtype-syndecan-1(WT-sdc-1),再通過體外定點(diǎn)突變技術(shù),將243位丙氨酸A突變?yōu)樘K氨酸T,244位絲氨酸S突變?yōu)樯彼醀,構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.0-unshedding-syndecan-1(uS-sdc-1),并進(jìn)行測序鑒定。 2.培養(yǎng)IEC-6、 Caco-2細(xì)胞2種細(xì)胞。分別設(shè)立陰性對照組、Vector轉(zhuǎn)染組、WT-sdcl轉(zhuǎn)染組及uS-sdc1轉(zhuǎn)染組,轉(zhuǎn)染24小時后,予1uM的佛波酯(PMA)刺激15分鐘后,用RT-PCR、 Dot blot及免疫熒光從基因及蛋白水平鑒定這2株細(xì)胞中syndecan-1的表達(dá)的情況。 3.實(shí)驗(yàn)分組：IEC-6、 Caco-2細(xì)胞分別設(shè)立陰性對照組、LPS刺激組(分別為LPS組、Vector+LPS組、WT-sdc-1+LPS組及uS-sdcl+LPS組),轉(zhuǎn)染24小時后加入1ug/ml的LPS刺激24h,分別提取總蛋白,漿蛋白及核蛋白,用Western blot檢測P65在各個處理組的總蛋白,漿蛋白及核蛋白中的表達(dá)情況,檢測IκBα在2種細(xì)胞總蛋白中的表達(dá)情況。 4.按上述方法將IEC-6、 Caco-2細(xì)胞分成5組,轉(zhuǎn)染24小時后加入1ug/ml的LPS刺激,分別于0h、6h、12h、24h、48h收集5個處理組的培養(yǎng)上清,用ELISA檢測TNF-α IL-1β、中性粒細(xì)胞趨化因子CINC-1的表達(dá)水平變化。 5.分離正常大鼠和人外周血的中性粒細(xì)胞,用Transwell小室模型檢測LPS刺激后的上清中的CINC-1對中性粒細(xì)胞的趨化作用。以LPS刺激后CINC-1產(chǎn)生最多的時間點(diǎn)的培養(yǎng)上清作為下室的趨化因素,上室按0.5×106個／孔加入用10%胎牛血清的培養(yǎng)基重懸中性粒細(xì)胞,趨化24小時后按公式：(遷入下室中性粒細(xì)胞數(shù)+多聚碳酸酯膜上的細(xì)胞數(shù))/上室加入中性粒細(xì)胞數(shù)×100%分別計(jì)算各處理組的遷移率。 6.本文數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。若樣本服從正態(tài)分布,進(jìn)行多個獨(dú)立樣本的單因素方差分析。方差齊時用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較；方差不齊時用Welch值代替F值,用Dunnett's T3檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較,若不服從正態(tài)分布,進(jìn)行多個樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)。P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每一個實(shí)驗(yàn)結(jié)果至少重復(fù)三次。 結(jié)果 1.真核表達(dá)載體pcDNA3.0-WT-sdc-1片段測序的結(jié)果,與GenBank中的syndecan-1基因序列相比完全一致,無突變；真核表達(dá)載體pcDNA3.0-unshedding-sdc-1目的突變點(diǎn)已成功發(fā)生突變,其余序列除了一處無義突變外,與GenBank中的syndecan-1基因序列完全一致,無突變。 2.PMA刺激前,Control組和Vector組幾乎不表達(dá)Syndecan-1。 WT-sdc-1和uS-sdc-1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞均強(qiáng)表達(dá)Syndecan-1mRMA和蛋白,細(xì)胞上清中僅檢測出少量脫落的Syndecan-1。PMA刺激后,各組mRMA表達(dá)無顯著改變；WT-sdc-1轉(zhuǎn)染組Syndecan-1的熒光強(qiáng)度較uS-sdc-1轉(zhuǎn)染組顯著減弱。上清中脫落的Syndecan-1含量顯著增加。 3. IEC-6、 Caco-2細(xì)胞各個處理組加LPS刺激,總蛋白中P65的表達(dá)在各個處理組間有顯著性差異(P0.05)。 Control組低于任何一個LPS刺激組。WT-sdc-1+LPS組和uS-sdc-1+LPS組均顯著低于LPS組及Vector+LPS組,(P0.05)。 uS-sdc-1+LPS組的P65表達(dá)量較WT-sdcl+LPS組減少。IκBα在2種細(xì)胞總蛋白中的表達(dá)趨勢與P65相同。 4.2種細(xì)胞漿蛋白中P65的表達(dá)在各個處理組間存在顯著性差異(P0.05)。Control組僅有微弱的目的條帶,LPS組和Vector+LPS組出現(xiàn)了較強(qiáng)的蛋白表達(dá)。目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值的比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。LPS組與WT-sdc-1+LPS組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。但LPS組顯著高于uS-sdc-1+LPS組(P0.05)。uS-sdc-1+LPS組與WT-sdc-1+LPS組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 5.2種細(xì)胞核蛋白中P65的表達(dá)在各個處理組間有顯著性差異(P0.05)。Control組僅有微弱的目的蛋白條帶,LPS組和Vector+LPS組出現(xiàn)了清晰的目的條帶,目的條帶/內(nèi)參條帶灰度值的比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。LPS組與WT-sdc-1+LPS組和uS-sdc-1+LPS組的比值相比有顯著性差異。(P0.05)。uS-sdc-1+LPS組的比值與WT-sdc-1+LPS組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 6.從組間比較,2種細(xì)胞LPS處理組細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α水平較Control組顯著增加(2種細(xì)胞的0h及Caco-2細(xì)胞的48h除外)(P0.05)。細(xì)胞表面Sydecan-1的表達(dá)量與TNF-α分泌量呈負(fù)相關(guān),WT-sdc-1+LPS組與uS-sdc-1+LPS組的表達(dá)均小于LPS組和Vector+LPS組。uS-sdc-1+LPS組的TNF-α表達(dá)量較WT-sdc-1+LPS減少。從時間上比較,在0h至12h范圍內(nèi),TNF-α分泌呈現(xiàn)增長趨勢,12-24h分泌趨近平臺期,24-48h分泌出現(xiàn)下降。 7.LPS刺激12h和48h時,IEC-6細(xì)胞uS-sdc-1+LPS組上清液中IL-1β的濃度最高,WT-sdc-1+LPS組的IL-1p濃度僅次于uS-sdc-1+LPS組。Control組IL-1p的濃度最低。刺激0h、6h、24h時各組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Caco-2細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1p在相同的時間點(diǎn)內(nèi),各個處理組之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 8.LPS刺激后,IEC-6細(xì)胞分泌的CINC-1在相同的時間點(diǎn)內(nèi)(0h除外)進(jìn)行比較,Control組的CINC-1濃度低于任何一個LPS刺激組。WT-sdc-1+LPS組的CINC-1分泌量較IEC-6+LPS組和Vector+LPS組減低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)而uS-sdc-1+LPS組與WT-sdc-1+LPS組比較,uS-sdc-1+LPS組的CINC-1顯著低于WT-sdc-1+LPS組(P0.05)。Caco-2細(xì)胞分泌的CINC-1在0h、6h、12h時各組間相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),在24h和48h時CINC-1在各組間差異與IEC-6細(xì)胞的相同。在0-48h內(nèi),IEC-6產(chǎn)生的CINC-1的濃度總體上有隨著時間增長而增加的趨勢Caco-2細(xì)胞產(chǎn)生的CINC-1在0h至12h范圍內(nèi),CINC-1分泌呈現(xiàn)增長趨勢,12-24h分泌趨近平臺期,24-48h分泌出現(xiàn)下降。Transwell各組遷移率與ELISA結(jié)果相符。 結(jié)論 1.成功構(gòu)建了pcDNA3.0-wildtype-syndecan-1載體和pcDNA3.0-unshedding-syndecan-1載體,pcDNA3.0-unshedding-syndecan-1載體在PMA刺激后確實(shí)可達(dá)到不脫落的效果。為研究syndecan-1在臨床IBD中的作用機(jī)制及基因治療奠定了基礎(chǔ)。 2.高表達(dá)的Syndecan-1可使NF-κB信號通路的表達(dá)及活性均下降,不脫落的Syndecan-1作用更為明顯,NF-κB信號通路是炎癥因子產(chǎn)生的上游,Syndecan-1可能通過抑制NF-κB信號通路發(fā)揮抗炎作用。 3.Syndecan-1表達(dá)增高可使炎癥因子TNF-α、 CINC-1的表達(dá)減少,不脫落的Syndecan-1作用較正常高表達(dá)的Syndecan-1更為明顯。Syndecan-1可通過抑制中性粒細(xì)胞的遷移及TNF-α、CINC-1的表達(dá)來抑制腸道炎癥程度。 4.高表達(dá)的Syndecan-1并不能減低LPS刺激下IL-1β的表達(dá)。IL-1p的調(diào)控錯綜復(fù)雜,Syndecan-1可能不是通過調(diào)節(jié)IL-1p的表達(dá)來影響炎癥反應(yīng)的。 5. Syndecan-1的表達(dá)增強(qiáng)或脫落減少可通過抑制炎癥信號通路的活性和減少炎癥因子的分泌而減輕炎癥的進(jìn)程。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R574

【參考文獻(xiàn)】

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