【摘要】：HCV是一種正單鏈RNA病毒,能夠通過感染宿主細胞,引發(fā)機體病毒性肝炎、肝纖維化乃至肝癌的發(fā)生。HCV的感染往往伴隨機體因天然免疫而引發(fā)的慢性炎癥反應,此過程有眾多模式識別受體的參與。 Toll樣受體是一類通過識別病原相關(guān)分子模式,介導機體天然免疫,并能作為橋梁連接機體天然免疫與獲得性免疫的一類重要模式識別受體。Toll樣受體能夠識別多種病原微生物的固有成分,介導機體針對多種病原菌與病毒的免疫反應。 TLR7存在于細胞內(nèi)體表面,通過識別包括I型HIV、手足口病及A型流感病毒在內(nèi)的多種單鏈RNA病毒,介導機體抗病毒免疫。TLR7被其配體激活后,通過下游接頭蛋白分子MyD88將激活信號向下游傳遞,最終激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB,進而產(chǎn)生多種促炎因子與I型干擾素,引起機體炎癥反應。TLR7屬于I型跨膜蛋白,由胞外區(qū)、跨膜區(qū)與胞內(nèi)區(qū)組成。其胞外區(qū)由多個富含亮氨酸的LRR區(qū)組成,主要參與TLR7與其配體的識別,跨膜區(qū)主要負責TLR7分子的錨定,而胞內(nèi)區(qū)則負責TLR7激活信號轉(zhuǎn)導過程。目前雖然研究發(fā)現(xiàn)多種單鏈RNA病毒感染所激活的天然免疫反應均有TLR7分子參與,但在HCV感染機體所引起的天然免疫應答過程中,TLR7的所起的作用尚不明確。此外,雖然TLR7分子通過其胞內(nèi)區(qū)將激活信號向下傳遞,但TLR7分子胞內(nèi)區(qū)介導信號轉(zhuǎn)導的具體機制還不清楚。 根據(jù)以上研究背景,本研究從HCV感染所激活機體天然免疫反應入手,闡明TLR7在HCV感染過程中的作用,并進一步從蛋白一級結(jié)構(gòu)影響功能的角度,解釋了TLR7被激活后通過胞內(nèi)區(qū)進行信號傳遞的具體機制。因此本研究主要從HCV感染過程中TLR7分子的作用與TLR7分子胞內(nèi)區(qū)結(jié)構(gòu)對信號傳遞的影響兩個方面,分為如下兩個部分進行: 1. HCV感染過程中TLR7分子的作用 本研究首先利用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HCV基因組的Huh7細胞所表達的HCV全基因組RNA刺激外周血單核細胞(PBMCs),通過ELISA檢測細胞因子表達量,我們發(fā)現(xiàn)HCV基因組RNA能夠刺激PBMCs顯著上調(diào)TNF-α與IFN-α。因此證實HCV可以通過其單鏈RNA基因組激活機體天然免疫反應。由于TLR7天然狀態(tài)下的配體為單鏈RNA病毒,因此該激活很可能通過TLR7介導。 由于在細胞內(nèi)體中病毒基因組將被降解成許多大小不等的寡聚核苷酸片段(ORNs),因此我們根據(jù)TLR7識別序列特點,以HCV基因組為模板人工合成多條ORNs,并用這些ORNs刺激新分離的PBMCs細胞,通過ELISA檢測我們證實位于1000位的ORN1000與位于HCV 3’端尾部的ORNHCVtail能夠刺激PBMCs上調(diào)TNF-α與IFN-α的表達。 TLR7被配體激活后將活化轉(zhuǎn)錄因子NF-κB與IRF7,從而啟動基因的表達。因此,我們利用人工合成的ORNs刺激Huh7細胞,通過雙熒光素酶報告基因檢測我們發(fā)現(xiàn)ORN1000與ORNHCVtail可以激活NF-κB與IRF7。 為了確定TLR7是否真的參與HCV感染過程所引起的免疫激活,我們通過RNA干擾技術(shù)發(fā)現(xiàn)當TLR7被干擾時, ORNs刺激細胞所造成NF-κB的激活強度明顯下降。而通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染使TLR7過表達后,NF-κB的激活強度顯著提高。因此,我們確定HCV基因組片段對于機體天然免疫反應的激活能夠通過TLR7進行的。 2. TLR7分子結(jié)構(gòu)對信號傳遞的影響 TLR7分子被激活后能夠通過一系列的信號轉(zhuǎn)導途徑激活基因表達。雖然TLR7通過胞內(nèi)區(qū)募集接頭蛋白MyD88從而激活信號通路已比較清楚,然而該分子具體通過胞內(nèi)區(qū)哪些位點介導對MyD88的募集卻尚無定論。因此我們對TLR7胞內(nèi)區(qū)蛋白的一級結(jié)構(gòu)進行分析,以期篩選出對TLR7信號轉(zhuǎn)導起關(guān)鍵作用位點,并解釋其產(chǎn)生作用的機制。首先,我們分析了TLR7胞內(nèi)區(qū)的序列特征,并且構(gòu)建了胞內(nèi)區(qū)全長與半長缺失體的真核表達質(zhì)粒,通過對雙熒光素酶報告基因檢測NF-κB的激活情況,我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染TLR7胞內(nèi)區(qū)全長與半長缺失體的實驗組與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的陰性對照組之間均無差別,因此我們將TLR7胞內(nèi)區(qū)的關(guān)鍵位點鎖定在胞內(nèi)區(qū)的后半段。接著,我們在胞內(nèi)區(qū)后半段以大約20個氨基酸為間隔構(gòu)建了一系列的缺失質(zhì)粒。通過檢測NF-κB激活情況,我們將關(guān)鍵位點鎖定在一個含有16個氨基酸的區(qū)域。然后,我們通過一系列位點特異性點突變的方法,證明這16個氨基酸中存在2個分別位于1004位與1006位的精氨酸能夠?qū)LR7功能產(chǎn)生影響。最后我們通過免疫共沉淀的方法證明,這2個精氨酸中只有1004位的精氨酸是通過影響TLR7與下游接頭蛋白MyD88的結(jié)合來影響TLR7信號傳遞的。 總之,本研究首先證實了HCV感染所引起的天然免疫反應由TLR7分子介導,TLR7分子激活信號的缺失將導致機體抗HCV感染免疫應答水平顯著下降。而進一步對TLR7分子結(jié)構(gòu)功能分析發(fā)現(xiàn),TLR7胞內(nèi)區(qū)位于1004位的精氨酸能夠通過影響TLR7與下游接頭蛋白MyD88結(jié)合的方式影響TLR7激活信號的轉(zhuǎn)導過程。該發(fā)現(xiàn)進一步闡明了TLR7信號傳遞機制的分子基礎,并為基于TLR7的臨床診斷與治療提供新的靶點。
【圖文】：

圖 1 HCV 基因組 RNA 激活天然免疫應答Figure1. Cytokine production by human PBMCs in response to HCV genomic RNAA and B) PBMCs were isolated and stimulated with HCV genomic RNA. IFN-α aNF-α were determined by ELISA after stimulation for 18 h. (C and D) PBMCs wesolated and plated in a 96-well plate. Increasing doses of HCV genomic RNA (from 0.o 0.5 μg/ml) were used to stimulate PBMCs, and IFN-α and TNF-α were determined LISA after stimulation for 18 h. Values represent mean value ± standard deviations hree independent experiments.（二）HCV 源寡聚核苷酸激活天然免疫天然狀態(tài)下許多病毒入侵機體后將被細胞吞噬入內(nèi)體，并在內(nèi)體完成脫衣殼等。在內(nèi)體內(nèi)，許多病毒的基因組將被降解成寡聚核苷酸，而其中某些寡聚核苷酸(ORNs)能夠刺激機體產(chǎn)生免疫反應。研究證明，pDC 對 HIV 病毒基因組中一段為 RNA40 的富含尿嘧啶的區(qū)域高度敏感，，以該區(qū)域序列為基礎合成的 ORN 可[9]

圖 2 HCV-ORN 激活天然免疫應答Figure2. Cytokine production by human PBMCs in response to HCV-ORNs and B) PBMCs were isolated and stimulated with HCV genomic RNA. IFN-αF-α were determined by ELISA after stimulation for 18 h. Values represent mean vstandard deviations of three independent experiments.三）HCV 源寡聚核苷酸激活 TLR7 信號通路HCV 感染是誘發(fā)肝細胞發(fā)生纖維化乃至癌變的重要因素，而 TLR7 信號通能在機體抵御 HCV 感染免疫過程中起重要作用。因此我們首先在肝癌細胞 He Huh7 內(nèi)檢測 TLR7 分子的表達情況。通過 Realtime PCR 與 Western blotting 檢們發(fā)現(xiàn) TLR7 分子在 Huh7 細胞中有表達（圖 3A）。TLR7 被配體激活后經(jīng)過一系列信號轉(zhuǎn)導，最終激活轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB 與 IRF動炎癥細胞因子與 I 型干擾素基因的表達[18]。因此，為了驗證根據(jù) HCV 基因人工合成的 ORNs 是否通過激活 TLR7 信號通路引起天然免疫應答，我們在 H
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R512.63

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本文編號：2640796