發(fā)布時間：2020-04-17 23:12

【摘要】： 內毒素(endotoxin, ET)主要的毒性成分脂多糖(lipopolysaccharide, LPS),是革蘭氏陰性(Gˉ)細菌細胞壁上的主要成份,也是Gˉ細菌最為重要的致病物質,可激活單核-巨噬細胞系統(tǒng)(mononuclear phagocytic system, MPS)引起腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白三烯(leukotriene)等細胞因子、炎癥介質大量釋放,導致肝損傷甚至是肝功能衰竭的發(fā)生,而機體或細胞經(jīng)小劑量LPS處理后所誘導的內毒素耐受(endotoxin tolerance,ETT)則對LPS的再次刺激呈低反應性。目前認為,內毒素耐受是生物在長期進化過程中形成的一種負反饋調節(jié)機制,是一種適應性應答,能避免機體對LPS刺激的持續(xù)過度反應,是機體防御機制的重要組成部分。這就提示如能調動機體的內源性抗損傷機制,使其在隨后受到細菌或毒素感染時,即能發(fā)揮抗感染的有益作用,又不致于引發(fā)過度炎癥反應,無疑對肝損傷的防治具有重要作用。我所諸多動物實驗和臨床研究發(fā)現(xiàn),各種慢性肝炎、肝硬化動物和患者均伴有腸源性內毒素血癥(IETM),有報道認為,小劑量LPS處理可以減輕急性肝損傷,而多次小劑量LPS處理與慢性肝損傷的關系及機制國內外報道尚屬罕見,值得進一步研究。 本論文共分兩部分。第一部分：多次小劑量LPS處理對CCl4誘導的慢性肝損傷的影響及其相關信號分子的變化；第二部分：多次小劑量LPS處理對非酒精性脂肪性肝炎發(fā)生發(fā)展的影響及其機制研究。 第一部分探討多次小劑量LPS處理對CCl4誘導的慢性肝損傷的影響及其相關信號分子的變化 實驗一多次小劑量LPS處理對CCl4誘導的慢性肝損傷的影響 選取雄性Wistar大鼠34只,隨機分為正常對照組、肝損傷組和LPS處理組。肝損傷組經(jīng)皮下注射CCl4并同時飼以高脂飲食誘導慢性肝損傷,LPS處理組經(jīng)腹腔注射小劑量LPS,余同肝損傷組。實驗第4周末大鼠在1%戊巴比妥鈉麻醉下,無菌無熱原條件下取腹主動脈血,用于測定內毒素水平和ALT活性；取肝組織測定TNF-α水平；制備肝臟切片,觀察肝臟病理改變。結果：肝損傷組血漿內毒素水平、ALT活性、肝勻漿TNF-α水平均明顯高于正常對照組；而經(jīng)小劑量LPS處理后血漿ALT活性、肝勻漿TNF-α水平顯著低于肝損傷組；肝組織切片HE染色結果發(fā)現(xiàn),肝損傷組肝細胞出現(xiàn)嚴重的脂肪變性,可見細胞核被擠壓在細胞邊緣；肝組織內可見肝細胞點狀及灶狀壞死,壞死區(qū)有以淋巴細胞為主的慢性炎細胞浸潤；而LPS處理組肝細胞內脂肪空泡以小空泡為主、數(shù)量少,肝脂肪變性明顯減輕,同時肝組織淋巴細胞浸潤少。經(jīng)統(tǒng)計學處理后提示CCl4所致肝損傷伴有腸源性內毒素血癥；經(jīng)多次小劑量LPS處理可以減輕肝損傷。 實驗二TLR4在多次小劑量LPS處理減輕CCl4誘導的慢性肝損傷中的作用 本部分實驗采用Western blotting測定各組肝組織中TLR4表達。實驗動物同實驗一。結果表明,肝損傷組TLR4表達與正常對照相比,明顯增強；經(jīng)多次小劑量LPS處理后肝組織中TLR4表達明顯下調,與肝損傷組相比差異有顯著性。 實驗三在多次小劑量LPS處理減輕CCl4誘導的慢性肝損傷中p38MAPK的表達 該實驗采用Western blotting觀察各組肝組織中p38MAPK表達的變化。實驗動物同實驗一。結果顯示,各組總p38MAPK表達一致,而pp38MAPK在肝損傷組的表達明顯增強,經(jīng)多次小劑量LPS處理后,顯著減弱。 實驗四在多次小劑量LPS處理減輕CCl4誘導的慢性肝損傷中NF-κB與IκB的表達 該實驗主要采用Western blotting觀察各組肝組織中NF-κB與IκB表達的變化。實驗動物同實驗一。結果：肝損傷組與正常對照組相比,NF-κB表達明顯增強,IκB表達明顯減弱；而LPS處理組NF-κB表達明顯減弱,IκB表達明顯增強。 實驗五在多次小劑量LPS處理減輕CCl4誘導的慢性肝損傷中IRAK-M的表達 該實驗主要采用Western blotting觀察各組肝組織中IRAK-M表達的變化。實驗動物同實驗一。結果：小劑量LPS處理可明顯增強肝組織IRAK-M表達水平,與肝損傷組相比差異有顯著性。 綜合第一部分的實驗結果,歸納如下：①CCl4誘導的慢性肝損傷大鼠模型體內存在腸源性內毒素血癥,腸源性內毒素也是造成慢性肝損傷的重要原因。②經(jīng)多次小劑量LPS處理可以減輕CCl4誘導的慢性肝損傷；③TLR4表達下調是LPS處理減輕慢性肝損傷的機制之一。④LPS處理可能通過上調IRAK-M水平,阻礙了MAPK信號轉導通路,從而使致炎因子,尤其是TNF-α產(chǎn)生減少,從而減輕了CCL4誘導的慢性肝損傷。 第二部分多次小劑量LPS處理對非酒精性脂肪性肝炎的影響及其機制研究 實驗六多次小劑量LPS處理對高糖高脂誘導的非酒精性脂肪性肝炎的影響 隨機將雄性Wistar大鼠分為正常對照組、肝損傷組和LPS處理組。肝損傷組飼以高糖高脂飲食,LPS處理組隔日經(jīng)皮下注射小劑量LPS,余同肝損傷組。分別在實驗第4周末、第9周末,1%戊巴比妥鈉麻醉下,無菌無熱原條件下取腹主動脈血,離心后檢測血漿ET、ALT、TNF-α、IL-10、APN、FPG, FINS水平。取肝左葉10%福爾馬林固定,石蠟包埋,5μm切片,做HE染色光鏡觀察肝組織病理變化,作TUNEL染色觀察各組肝細胞凋亡變化。結果：4周肝損傷組內毒素、ALT水平均略高于正常組,差異沒有顯著性；9周肝損傷組血漿內毒素水平、ALT水平均明顯高于正常對照組,提示肝損傷組大鼠體內形成了腸源性內毒素血癥,肝組織損傷明顯,肝組織切片HE染色也顯示,9周肝損傷組肝臟出現(xiàn)以大泡性脂滴為主的脂肪變性,肝小葉和匯管區(qū)有大量炎細胞浸潤,可見點狀和灶狀壞死,而9周LPS處理組血漿ALT水平明顯降低,脂肪數(shù)量少、空泡小,脂肪變性明顯減輕；LPS處理組促炎因子TNF-α水平降低,抗炎因子IL-10水平升高,Th1/Th2降低。肝細胞作為LPS的靶細胞,經(jīng)小劑量LPS處理,凋亡率低于肝損傷組,差異有顯著性。 試驗七多次小劑量LPS處理對胰島素抵抗和胰島β細胞凋亡的影響 該實驗通過采用TUNEL法觀察胰島β細胞凋亡的改變。結果,經(jīng)小劑量LPS處理后,β細胞凋亡明顯減少；胰島素抵抗指數(shù)比肝損傷組有所降低,但差異沒有顯著性,可能與試驗時間短有關。 綜合第二部分的實驗結果,歸納如下：①高糖高脂誘導的非酒精性脂肪性肝炎存在腸源性內毒素血癥,腸源性內毒素可能是非酒精性脂肪性肝炎發(fā)生發(fā)展的重要原因；②多次小劑量LPS處理可以減輕非酒精性脂肪性肝炎；③TH1/TH2下降可能是多次小劑量LPS處理減輕肝損傷的機制之一；④肝細胞凋亡下降與肝損傷減輕相關；⑤多次小劑量LPS處理可使胰島β細胞凋亡減少、胰島素抵抗指數(shù)下降。 綜上所述,得出以下結論： 1、經(jīng)多次小劑量LPS處理均可減輕CCl4及高糖高脂對大鼠所致的慢性肝損傷。 2、多次小劑量LPS處理減輕CCl4所致的慢性肝損傷與受體和信號轉導通路受阻致使致炎因子,主要是TNF-α的減少有關。 3、多次小劑量LPS處理減輕高糖高脂所致的非酒精性脂肪肝炎及其相關的胰島素抵抗和p細胞凋亡下降與M1/M2(與TH1/TH2相對應)比值下降有關。 4、無論CCl4還是高糖高脂所致的肝損傷均與激活巨噬細胞相關,而多次小劑量LPS處理減輕肝損傷可能都是通過抑制巨噬細胞實現(xiàn)的。
【圖文】：

肝損傷組血漿內毒素水平明顯高于正常對照組(尸<肝損傷模型大鼠在第4周時在體內形成了腸源性內毒素血癥;而低于肝損傷組，，統(tǒng)計學差異沒有顯著性。這個結果表明，導致，腸源性內毒素也發(fā)揮了重要作用。性變化2.結果顯示，肝損傷組血漿Al丁r活性明顯高于正常對照組，統(tǒng)計)，提示經(jīng)CCh誘導的大鼠模型有慢性肝損傷形成。經(jīng)小劑量顯低于肝損傷組，統(tǒng)計學差異有顯著性(P<0.01)，提示，該

theliverofratstreatedwithCC14.又士s，n=8 (*P<0.05vsETT)圖1一3小劑量LPS處理對CC14誘導大鼠肝組織勻漿TNF一含量的影響TNF一a是引起肝損傷的重要促炎細胞因子，可由LPs誘導Kupffer細胞產(chǎn)生。本實驗檢測了經(jīng)皮下注射40%cch油溶液4周后肝臟TNF一a含量變化。Fig.1一3.結果表明，CCh所致肝損傷組，肝勻漿詡F一a水平明顯高于正常對照組(p<0.01)，雖LPS處理組肝勻漿TNF一a水平仍高于對照組，但卻明顯低于肝損傷組(p<0.05)，提示，I’NF一a分泌減少，是多次小劑量LPS處理抑制CCL4慢性肝損傷主要機制之一�？傊�
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R575

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本文編號：2631416