【摘要】： 隨著全腸外營養(yǎng)支持(TPN)和家庭腸外營養(yǎng)支持(HPN)治療的進步,不少因短腸綜合征而導致腸功能衰竭的患者已經能夠獲得較為滿意的生活質量。但是終究無法擺脫嚴重的、甚至致命的并發(fā)癥的威脅,如導管感染、嚴重的膽汁淤積和慢性繼發(fā)性肝病等。當腸衰竭患者合并有不可逆性肝損傷時就需要進行肝-腸聯(lián)合移植。盡管小腸移植的生存率在逐年提高,隨著新的免疫抑制劑的應用,小腸移植的病人一年生存率已與肝臟移植病人接近。但供體的缺乏等因素,仍然是目前很難解決的問題。使腸蠕動速度減慢的手術方式不符合生理,效果不滿意,能獲益者甚少,甚至是有害無益。 位于隱窩底部潘氏細胞之上的未分化細胞,是能夠分化出小腸粘膜成熟上皮細胞的多能干細胞。正是小腸粘膜干細胞的各種特性維持著小腸粘膜的完整性及小腸粘膜細胞的不斷周期性更新。小腸粘膜干細胞的研究已經有三十多年的歷史。目前多數(shù)研究認為小腸粘膜類器官片段來源的小腸邊緣群(side-population,SP)細胞是能夠干細胞的細胞群體,本研究目的在于分析大鼠小腸粘膜SP細胞的生物學特性,并進一步探索其在短腸綜合征大鼠的移植治療作用。 第一部分:大鼠胎鼠小腸粘膜邊緣群細胞生物學特性研究 目的:分離邊緣群(side population,SP)細胞是富集干細胞的有效技術手段,近期實驗證實小鼠來源的小腸粘膜SP細胞富集小腸粘膜干細胞。本研究目的在于分析大鼠來源的SP細胞生物學特性,為小腸粘膜SP細胞在大鼠模型中的應用提供實驗依據。 方法:取Wistar大鼠胎鼠小腸全長,按文獻方法制作小腸粘膜的類器官片段并制備成單細胞懸液。使用Hoechst33342和PI (Propidium iodide)染色后用流式細胞儀分選SP細胞。提取分選前后的細胞總RNA和蛋白,用實時定量PCR及Western-blot方法分別檢測其中Musashi-1mRNA及Musashi-1蛋白的表達水平。結果:流式細胞分選儀圖形顯示大鼠胎鼠來源的小腸粘膜單細胞懸液的細胞群圖形呈“鳥嘴樣”,且染色液中加入維拉帕米后“鳥嘴”部分即SP細胞群消失。定量PCR及Western-blot檢測顯示SP細胞中Musashi-1mRNA含量是分選前細胞的8.125倍,是非SP細胞的20.077倍。Western-blot結果顯示Musashi-1蛋白水平明顯高于分選前。 結論:大鼠胎鼠的SP細胞富集小腸粘膜干細胞,與小鼠來源的SP細胞生物學特性基本一致。 第二部分:移植小腸粘膜邊緣群細胞治療大鼠短腸綜合征的實驗研究 目的:觀察移植小腸粘膜SP細胞對短腸綜合征大鼠的治療作用。方法:Wistar大鼠切除75%小腸后隨機分成實驗組(n=9)和對照組(n=11)。手術后第五天所有大鼠給予全身照射(300cGy),照射后24小時內實驗組在顯微鏡下將5×105小腸粘膜SP細胞注射到大鼠小腸粘膜下,對照組注射同樣體積的1×HBSS。每日稱量大鼠體重,移植四個月后檢測木糖吸收實驗、氮平衡實驗、脂肪平衡實驗,處死大鼠后測定小腸長度、濕重、面積,并行組織學檢測,統(tǒng)計絨毛高度、隱窩深度及絨毛密度。 結果:移植四個月后,實驗組大鼠體重及移植后增長體重(280±23g,122±25g)明顯均高于對照組(252±21g,98±23g)(P0.05)。實驗組小腸長度(39.0±9.8cm)明顯高于對照組(26.5±6.7cm)(P0.01);實驗組的木糖吸收率(0.17±0.07%)明顯高于對照組(0.10±0.04%)(P0.05);實驗組和對照組脂肪吸收率分別為0.98±0.01%和0.86±0.08%,實驗組明顯高于對照組(P0.05)。實驗組和對照組氮總利用率分別為0.53%±0.14%和0.38%±0.17%,實驗組明顯高于對照組(P0.05)。 結論:移植小腸粘膜SP細胞能夠增加小腸的吸收面積和吸收能力。 第三部分:穩(wěn)定性同位素示蹤法檢測移植小腸粘膜SP細胞后小腸吸收能力的變化 目的:本研究目的在于檢測移植小腸粘膜SP細胞后的大鼠對同位素標記的氨基酸吸收能力的變化,研究移植后大鼠小腸吸收能力的變化。 方法:實驗組、對照組和正常組大鼠,用15N標記的亮氨酸(0.25g/kg)灌胃,在灌胃后15分鐘、0.5h、1h、2h抽血,測定各血清標本中的15N—Leucine豐度。根據不同時間15N—Leucine在血清中的豐值繪制吸收曲線。通過15N—Leucine在血中豐度的峰值和豐度時相曲線下面積判斷15N—Leucine的吸收情況。 結果:實驗組與對照組均在半小時達到吸收高峰,實驗組吸收曲線下面積為正常組的70%,對照線吸收曲線下面積為正常組37%。實驗組明顯高于對照組(P0.01)。 結論:小腸粘膜SP細胞移植能增強短腸大鼠對氨基酸吸收能力。 第四部分:地高辛標記的原位雜交法檢測供體細胞在受體小腸內分布 目的:應用地高辛標記的原位雜交方法,檢測雄性大鼠的小腸粘膜SP細胞在受體小腸內的分布增殖情況。 方法:大鼠麻醉后處死,取小腸制備12μm切片,進行原位雜交檢測。結果:在移植組的大鼠小腸標本中,顯著增生部位的隱窩及絨毛部位均能檢測到細胞核中Y染色體存在的標志供者來源細胞。 結論:結果證明供體來源的細胞能較長時間在受體小腸內生存并參與小腸粘膜的修復與再生,結合前面的研究結果,表明小腸粘膜SP細胞移植對短腸綜合征大鼠治療有重要意義。
【圖文】：

圖 1 流式細胞儀分選圖。A）分選細胞在含有 5mg/mlHoechst33342 的 1×HBSS 中孵育。B) 孵育液中加用 100 μmol/L 維拉帕米2. 小腸粘膜 SP 細胞的 Musashi-1的表達1) Musashi-1mRNA 水平實時定量 RT-PCR 結果顯示 SP 細胞中的 Musashi-1mRNA 含量是分選前的8.125 倍，是非 SP 細胞的 20.077 倍(圖 2、3)。

0123456789M SP NFoldValueal time -PCR 分析 Musashi-1mRNA 的相對含量，M(mix),SP,N 分選后的 SP細胞和非 SP 細胞。
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R574

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據庫 前2條

1 黎介壽;成人短腸綜合征的治療進展[J];腸外與腸內營養(yǎng);2005年05期

2 仇惠英;薛永權;潘金蘭;吳亞芳;陳蘇寧;孫愛寧;吳德沛;;熒光原位雜交法檢測造血干細胞移植后骨髓嵌合狀態(tài)和微量殘留病灶[J];中華器官移植雜志;2006年08期

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本文編號：2621238