【摘要】： 第一章：雙歧桿菌CMS-H004株加重UC損傷的實(shí)驗(yàn)研究 目的： 在前期研究發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌CMS-H004株有加重UC損傷作用的基礎(chǔ)上，用多株雙歧桿菌比較的方法，驗(yàn)證是否CMS-H004株具有加重UC損傷的株特異性。 方法： Balb／c小鼠70只，隨機(jī)分為7組：1)正常組；2)模型組；3)陰性對(duì)照(NS組)；4)陽(yáng)性對(duì)照(5-ASA組)；5)CMS-H004組；6)PFK組；7)JSQ組。5％DSS溶液自由飲用7天造成小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎模型，通過(guò)觀察、檢測(cè)小鼠癥狀、體征、疾病活動(dòng)度評(píng)分、病理組織學(xué)評(píng)分、電鏡結(jié)構(gòu)、結(jié)腸長(zhǎng)度、腸道菌群分析、髓過(guò)氧化物酶活性、腫瘤壞死因子濃度等指標(biāo)，評(píng)估雙歧桿菌CMS-H004株與培菲康、金雙歧中的雙歧桿菌菌株對(duì)DSS誘導(dǎo)的UC的影響。 結(jié)果： 雙歧桿菌CMS-H004株能夠明顯加重DSS誘導(dǎo)的UC模型損傷。其相當(dāng)于人類(lèi)UC的臨床表現(xiàn)項(xiàng)目如：體重下降、隱血、血便及死亡時(shí)間等出現(xiàn)得最早，便血率、死亡率最高，疾病的DAI積分最高，粘膜損傷的病理學(xué)改變也最嚴(yán)重，結(jié)腸MPO活性最高，與其它各組比較有顯著性差異(P＜0.05)。PFK、JSQ菌株以上各項(xiàng)損傷指標(biāo)均沒(méi)有DSS組嚴(yán)重。飲用DSS后腸道乳酸桿菌數(shù)目減少，擬桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌明顯增加，腸球菌、雙歧桿菌和總需氧菌無(wú)明顯變化；CMS-H004組菌群變化與模型組相似，其雙歧桿菌數(shù)目并未增加。 結(jié)論： 1)在結(jié)腸粘膜有損傷的基礎(chǔ)上，雙歧桿菌CMS-H004株能夠加重黏膜損傷； 2) DSS可使腸道乳酸桿菌減少，而不影響雙歧桿菌數(shù)量；應(yīng)用雙歧桿菌CMS-H004株與其相似，但并不增加腸道雙歧桿菌。 第二章：雙歧桿菌CMS-H004株加重UC損傷的機(jī)理研究 目的： 從炎癥因子、緊密連接、防御素不同角度體內(nèi)、體外初步探討雙歧桿菌CMS-H004株加重UC損傷的機(jī)理。 方法： Balb／c小鼠45只，隨機(jī)分為3大組、9小組：N3、N5、N7是正常組第3、5、7天：M3、M5、M7是DSS模型組飲用DSS后第3、5、7天；B3、B5、B7是CMS-H004菌株灌腸組飲用DSS后第3、5、7天。5％DSS溶液自由飲用7天造成小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎模型。RT-PCR和免疫印跡法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)結(jié)腸組織IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)；免疫印跡法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)結(jié)腸緊密連接蛋白ZO-1和β-防御素-2蛋白質(zhì)的表達(dá)。 體外培養(yǎng)HT-29細(xì)胞，與雙歧桿菌CMS-H004株、PFK株共孵育1小時(shí)后用TNF-α刺激3小時(shí)，檢測(cè)其上清LDH含量和NF-κB轉(zhuǎn)錄入細(xì)胞核的數(shù)目。 結(jié)果： 1)飲用DSS誘導(dǎo)損傷后IL-1β、IL-6、TNF-α均開(kāi)始有表達(dá)，但CMS-H004組在飲用DSS第3天后出現(xiàn)表達(dá)，而模型組是在飲用DSS第5天后出現(xiàn)，同一時(shí)間點(diǎn)CMS-H004組IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)量高于模型組，正常組幾乎不表達(dá)以上炎癥因子。 2)正常組小鼠結(jié)腸高表達(dá)ZO-1蛋白，飲用DSS 7天后模型組和CMS-H004組ZO-1蛋白表達(dá)均低于正常組，模型組和CMS-H004組表達(dá)量無(wú)顯著性差異。 3)正常組小鼠結(jié)腸幾乎不表達(dá)BD-2蛋白，模型組和CMS-H004組在飲用DSS第5天后即有BD-2表達(dá)，但CMS-H004組BD-2表達(dá)量比模型組少。 4) TNF-α刺激HT-29細(xì)胞后各組培養(yǎng)液上清中LDH含量無(wú)顯著性差異。 5) TNF-α體外刺激HT-29細(xì)胞后，除正常組外均均有NF-κB轉(zhuǎn)錄入核，其中CMS-H004組數(shù)目最多。 結(jié)論： 1)雙歧桿菌CMS-H004株能夠促進(jìn)炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α提前釋放； 2)雙歧桿菌CMS-H004株能夠促進(jìn)腸上皮細(xì)胞NF-κB轉(zhuǎn)錄入核； 3) DSS和CMS-H004株能破壞腸上皮細(xì)胞緊密連接、誘導(dǎo)β-防御素-2表達(dá)，可能不是CMS-H004株加重?fù)p傷的主要機(jī)制。 第三章：CMS-H004菌株的分離、鑒定與相關(guān)研究 目的： 為后續(xù)可能的開(kāi)發(fā)、臨床研究及專(zhuān)利要求，進(jìn)一步對(duì)CMS-H004專(zhuān)利菌株進(jìn)行鑒定和相關(guān)研究，并將其保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)。 方法： 通過(guò)光鏡、電鏡觀察其形態(tài)學(xué)特征；通過(guò)生化反應(yīng)、X-gal顯色、代謝產(chǎn)物檢測(cè)觀察CMS-H004菌株生理、生化特征；通過(guò)(G+C)mol％測(cè)定、16SrRNA、質(zhì)粒檢測(cè)觀察其遺傳學(xué)特性；通過(guò)體外耐酸耐膽汁、抗生素敏感實(shí)驗(yàn)，研究其相關(guān)特性。 結(jié)果： 1) CMS-H004株是革蘭氏染色陽(yáng)性桿菌，在MRS瓊脂平皿上呈現(xiàn)圓形，白色，隆起，不透明，邊緣整齊的濕潤(rùn)菌落。 2) CMS-H004株能利用葡萄糖、甘露醇、乳糖、蔗糖、麥芽糖、水楊素、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、七葉靈、甘油、纖維二糖、海藻糖、松三糖、棉子糖、山梨醇、鼠李糖，API 20A編碼為：47757732。 3) CMS-H004株主要代謝產(chǎn)物是乙酸和乳酸，比值約為2.63：1，還可產(chǎn)生少量琥珀酸。 4) CMS-H004株(G+C)mol％為58.64％，無(wú)質(zhì)粒。利用雙歧桿菌特異性引物能夠產(chǎn)生預(yù)期的擴(kuò)增條帶。 5) CMS-H004株體外能夠耐酸、耐膽汁。 6)氯霉素、氧哌嗪青霉素、四環(huán)素、頭孢孟多、先鋒噻唑、米諾環(huán)素、阿奇霉素、利福平對(duì)CMS-H004株抑菌圈均大于10mm，慶大霉素抑菌圈為7.5mm左右，其余33種抗生素?zé)o明顯抑菌圈。 結(jié)論： 1) CMS-H004株是青春雙歧桿菌的一株，已保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其典藏編號(hào)是：CCTCC M 206119。 2) CMS-H004株能夠耐酸、耐膽汁，可以經(jīng)過(guò)上消化道定植于腸道。 3) CMS-H004株對(duì)氯霉素、氧哌嗪青霉素、四環(huán)素、頭孢孟多、先鋒噻唑、米諾環(huán)素、阿奇霉素、利福平敏感，對(duì)慶大霉素中度敏感，，對(duì)其余33種抗生素耐藥。 第四章：雙歧桿菌CMS-H004株抗體的制備與檢測(cè) 目的： 制備雙歧桿菌CMS-H004株的兔多克隆抗體。 方法： 提取CMS-H004株菌體蛋白，加入佐劑作為抗原常規(guī)免疫新西蘭大白兔。達(dá)到一定效價(jià)后取血清，飽和硫酸銨沉淀法鹽析、透析脫鹽初步純化兔IgG。用ELISA、免疫印跡和免疫培養(yǎng)的方法檢測(cè)該抗體的最佳使用濃度、特異性、敏感性，并用此抗體檢測(cè)UC患者與正常人糞便中的CMS-H004菌株。 結(jié)果： 1)雙歧桿菌CMS-H004株能刺激產(chǎn)生兔多克隆抗體，隨著抗體濃度不斷降低，與CMS-H004菌體蛋白反應(yīng)也下降，在0.05μg/ml以下反應(yīng)很弱且變化不大，選用0.5μg／ml為最佳使用濃度。 2)不同細(xì)菌與抗體(0.5μg／ml)反應(yīng)，抗體與雙歧桿菌CMS-H004菌體蛋白的反應(yīng)最強(qiáng)，有顯著性差異(P＜0.05)；雙歧桿菌PFK、JSQ反應(yīng)次之，而乳酸桿菌CMS-H001、CMS-H002及NS幾乎無(wú)反應(yīng)。 3)部分正常人(4／20)和部分潰瘍性結(jié)腸炎患者(3／12)糞便中可見(jiàn)少量CMS-H004菌落生長(zhǎng)，其余潰瘍性結(jié)腸炎(9／12)患者糞便中可見(jiàn)大量菌落生長(zhǎng)。 結(jié)論： 1)雙歧桿菌CMS-H004株能刺激新西蘭大白兔產(chǎn)生抗體，抗體濃度、特異性、敏感性較好。 2)小樣本檢測(cè)顯示雙歧桿菌CMS-H004株存在于20％正常人和所有UC患者糞便中。
【圖文】：

中南大學(xué)博士學(xué)位論文第一章實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、小鼠體重改變飲用DSS可以造成腹瀉、便血等癥狀，會(huì)導(dǎo)致小鼠體重下降，癥狀越嚴(yán)重體重下降越多。實(shí)驗(yàn)前及飲用DSS前各組小鼠體重差異無(wú)顯著性，正常組小鼠體重逐漸增加，而飲用DSS后，CMS一HO04組體重下降最早(飲用DSS第2天后就出現(xiàn))、最多，與其余各組比較具有顯著性差異(P<0.05)。模型組、NS組、5一ASA組、PFK組、JsQ組小鼠體重在飲用DSS后第4天均開(kāi)始明顯下降，與正常組比較均有顯著性差異(P<0.05)，其中5一ASA組體重下降相對(duì)少。見(jiàn)圖l一l。

腸內(nèi)可見(jiàn)血便，以CMS一HO04組小鼠最為嚴(yán)重。而5一ASA組、PFK組、JsQ組結(jié)腸平均長(zhǎng)度長(zhǎng)于CMS一H004組、模型組和NS組，少量小鼠結(jié)腸內(nèi)可見(jiàn)少量出血，大部分小鼠結(jié)腸內(nèi)未見(jiàn)明顯血便。見(jiàn)圖1一2(A一G)。
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類(lèi)號(hào)】：R574.62

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2620561