【摘要】：乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HepatitisBVirus,HBV)引起的一種傳染病,全球范圍內(nèi)普遍存在且嚴(yán)重影響人類健康。HBV感染對(duì)肝臟可引起不同程度的損害,包括急性自愈性感染、慢性肝炎、暴發(fā)性肝炎、肝硬化和肝癌。目前,以乙型肝炎表面抗原(Hepatitis B Surface Antigen,HBsAg)作為基礎(chǔ),將 HBV 分為 adw、adr、ayw 和 ayr四個(gè)主要的血清型,同時(shí),根據(jù)全基因組核苷酸序列的差異將HBV分為A～19個(gè)基因型。目前的很多研究表明,HBV血清型與基因型在乙肝臨床表現(xiàn)、病情進(jìn)展、對(duì)干擾素治療和預(yù)后等方面都有不可忽視的影響。HBV的血清型與基因型在不同的人種及地區(qū)之間的分布有所差異,而研究探討這部分內(nèi)容則有助于對(duì)HBV的臨床結(jié)局分析、抗病毒療效以及HBV基因突變位點(diǎn)的分析,對(duì)進(jìn)一步認(rèn)識(shí)HBV的生物學(xué)特性具有重要意義。本研究將建立一種特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高的檢測(cè)HBV血清型的ELISA方法,探討我國(guó)乙肝患者HBV血清型及基因型的分布特點(diǎn)及其與臨床的關(guān)系,具體進(jìn)行以下方面的研究:1.建立分泌抗HBsAg表位單克隆抗體細(xì)胞株以HBsAg亞型蛋白adr、adw、ay作為抗原免疫小鼠。經(jīng)過(guò)三次免疫后,小鼠尾部血清效價(jià)在1×10-4左右。經(jīng)過(guò)細(xì)胞融合技術(shù)和雜交瘤篩選技術(shù),篩選出4株分泌特異性識(shí)別HBsAg表位“d”、“y”、“r”、“w”抗體的雜交瘤細(xì)胞株,代號(hào)分別為#2.1-4.2、#7-7-2、#18.1-23-3.1 和#56.2-71-5.2。2.抗HBsAg表位單克隆抗體的獲得將4株細(xì)胞株在無(wú)血清培養(yǎng)基MD6中大量培養(yǎng),通過(guò)Protein A進(jìn)行親和層析純化,獲得單克隆抗體。利用間接ELISA方法對(duì)獲得的四株單克隆抗體的特異性進(jìn)行分析,結(jié)果表明#2.1-4.2特異性識(shí)別HBsAg“d”表位,#7-7-2特異性識(shí)別HBsAg“y”表位,#18.1-23-3.1特異性識(shí)別HBsAg“r”表位,#56.2-71-5.2特異性識(shí)別HBsAg“w”表位。另外,#2.1-4.2 與#7-7-2 不競(jìng)爭(zhēng)同一表位,#18.1-23-3.1 與#56.2-71-5.2 不競(jìng)爭(zhēng)同一表位。四株抗體的親和力均在109L/mol以上。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示,抗體輕、重鏈條帶明顯,無(wú)其它雜帶。#2.1-4.2、#18.1-23-3.1及#56.2-71-5.2的單克隆抗體重鏈亞型為IgG2b,#7-7-2的重鏈亞型為IgG1,四株單克隆抗體的輕鏈亞型均為κ。我們根據(jù)HBsAg血清型氨基酸序列設(shè)計(jì)了四條多肽序列R1、W1與R2、W2,利用ELISA方法鑒定抗體的抗抗原位點(diǎn)。結(jié)果顯示,#18.1-23-3.1抗體相對(duì)應(yīng)的抗原位點(diǎn)可能是R1的氨基酸序列,#56.2-71-5.2抗體相對(duì)應(yīng)的抗原位點(diǎn)可能是W1的氨基酸序列。3.特異性HBV血清型檢測(cè)方法的建立利用以上四株單克隆抗體為原料建立一種特異性HBV血清型檢測(cè)方法,并對(duì)包被濃度、HRP二抗使用濃度、反應(yīng)溫度及時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化,檢測(cè)各ELISA的靈敏度及特異性。首先,將四種單克隆抗體進(jìn)行HRP標(biāo)記,計(jì)算出最佳工作濃度后(1:8,000),與抗“a”表位的單克隆抗體#3-11-2.1分別組合成雙抗體夾心ELISA。經(jīng)過(guò)對(duì)ELISA條件的優(yōu)化及比較,結(jié)果顯示,#3-11-2.1的最佳包被濃度為1.0 μg/mL,樣本最佳加樣量為10μL;ELISA樣本反應(yīng)溫度為37℃,反應(yīng)時(shí)間為30 min,且一步法ELISAL比兩步法ELISA檢測(cè)的準(zhǔn)確率高。對(duì)建立的檢測(cè)方法做出以下評(píng)價(jià):(1)特異性較高,#3-11-2.1抗體包被,#2.1-4.2-HRP作為二抗的夾心ELISA方法能特異性地檢測(cè)“d”表位;同樣,#3-11-2.1包被,#7-7-2-HRP的夾心ELISA能特異性地檢測(cè)“y”表位;#3-11-2.1包被,#18.1-23-3.1-HRP 的夾心 ELISA 檢測(cè)“r”表位;#3-11-2.1 包被,#56.2-71-5.2-HRP 的夾心 ELISA 能特異性地檢測(cè)“w”表位。(2)四種夾心方法都具有良好的線性區(qū)間,R值均在0.99以上,靈敏度在納克級(jí)水平,批內(nèi)變異系數(shù)均在10%以下,批間變異系數(shù)均在15%以下。(3)與PCR及測(cè)序方法比較,兩種方法檢測(cè)HBV血清型的結(jié)果差異不顯著。4.我國(guó)HBV血清型及基因型的初步探討收集HBV血清樣本,通過(guò)建立的HBV血清型檢測(cè)方法及PCR測(cè)序法,成功分析了這些樣本的血清型及基因型。在408例HBV陽(yáng)性樣本中,adr血清型330例,adw血清型50例,ayr和ayw血清型各14例;B基因型116例,C基因型255例,D基因型37例,未發(fā)現(xiàn)A、E、F、G、H等基因型。不同血清型、基因型的性別分布沒(méi)有顯著差異。另外,不同血清型、基因型患者的年齡段分布沒(méi)有顯著差異。HBV基因組DNA(HBVDNA)水平、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotransferase,ALT)水平以及HBeAg陽(yáng)性率在各血清型以及基因型中差異顯著。adr血清型中HBVDNA、ALT水平最高,其次是adw及ayr,最低的是ayw;HBeAg陽(yáng)性率adw最高,其次是adr及ayw,最低為ayr。C基因型HBV DNA、ALT水平以及HBeAg陽(yáng)性率最高,D基因型HBV DNA、ALT水平高于B基因型,B基因型HBeAg陽(yáng)性率多于D基因型。HBV血清型與基因型在我國(guó)的分布有顯著差異。Adr為我國(guó)主要血清型,在全國(guó)范圍內(nèi)均有所分布;adw血清型主要集中于南方地區(qū);ayr及ayw主要分布在新疆地區(qū)�；蛐虲是我國(guó)的優(yōu)勢(shì)基因型,在各個(gè)地區(qū)均有分布;B基因型集中分布于華東、華中及華南地區(qū);基因型D則主要出現(xiàn)在新疆地區(qū)。本研究建立的雙抗體夾心ELISAHBV血清型檢測(cè)方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便,而且,我們對(duì)來(lái)自中國(guó)大范圍地區(qū)的HBV感染者樣本同時(shí)進(jìn)行血清型與基因型的檢測(cè),結(jié)果相對(duì)更具有代表性和真實(shí)性,更能準(zhǔn)確地反應(yīng)我國(guó)HBV感染者基因型及血清型的地理分布特征。這為研究病毒變異、探討HBV發(fā)病機(jī)制和流行病學(xué)提供了有力工具。
【圖文】：

ＨＢＶ主要以三種形式存在。第一種是圓球狀顆粒，直徑４２邋ｍｎ，是具有感染性的完逡逑整的ＨＢＶ。此種病毒在１９６５年由丹娜發(fā)現(xiàn)，所以又被稱為丹娜顆粒（Ｄａｎｅ顆粒）。逡逑Ｄａｎｅ顆粒包括外殼和核心兩個(gè)部分（如圖１－２）。夕卜殼厚７－８邋ｎｍ，由脂質(zhì)雙層和蛋白質(zhì)逡逑組成。脂質(zhì)雙層內(nèi)有前Ｓ１蛋白、前Ｓ２蛋白和Ｓ蛋白，它們又構(gòu)成了外殼大、中、小三逡逑種蛋白形式，統(tǒng)稱為ＨＢｓＡｇ。核心顆粒直徑２８邋ｎｍ，是呈二十面體立體對(duì)稱的結(jié)構(gòu)，它逡逑的表面是病毒真正的衣殼，稱為ＨＢｃＡｇ，由１８３個(gè)氨基酸組成。Ｄａｎｅ顆粒的中心部位逡逑則是部分雙鏈和單鏈的環(huán)狀ＤＮＡ和依附在上面的ＤＮＡ聚合酶。第二種顆粒為小圓球逡逑顆粒，直徑２２邋ｎｍ，是ＨＢｓＡｇ的主要組分，在血清中大量存在。這類顆粒是屬于ＨＢＶ逡逑多余的衣殼蛋白，沒(méi)有傳染性，但可以刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，所以具有中和病毒的逡逑作用，并可用于制備乙肝疫苗。ＨＢＶ第三種為管狀顆粒，直徑與第二種顆粒相同，長(zhǎng)逡逑度為５０－２３０邋ｎｍ，均屬于ＨＢｓＡｇ，也是ＨＢＶ多余的衣殼蛋白，同樣也無(wú)傳染性［１８

ｍＲＮＡｓ逡逑＾翁逡逑ＡＡＡ＾邐—＊＾逡逑ＨＢｘｍＲＮＡ逡逑圖１－１邋ＨＢＶ基因組［１７］逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｇｅｎｏｍｅ邋ｏｆ邋ＨＢＶ逡逑ＨＢＶ主要以三種形式存在。第一種是圓球狀顆粒，直徑４２邋ｍｎ，，是具有感染性的完逡逑整的ＨＢＶ。此種病毒在１９６５年由丹娜發(fā)現(xiàn)，所以又被稱為丹娜顆粒（Ｄａｎｅ顆粒）。逡逑Ｄａｎｅ顆粒包括外殼和核心兩個(gè)部分（如圖１－２）。夕卜殼厚７－８邋ｎｍ，由脂質(zhì)雙層和蛋白質(zhì)逡逑組成。脂質(zhì)雙層內(nèi)有前Ｓ１蛋白、前Ｓ２蛋白和Ｓ蛋白，它們又構(gòu)成了外殼大、中、小三逡逑種蛋白形式，統(tǒng)稱為ＨＢｓＡｇ。核心顆粒直徑２８邋ｎｍ，是呈二十面體立體對(duì)稱的結(jié)構(gòu)，它逡逑的表面是病毒真正的衣殼，稱為ＨＢｃＡｇ，由１８３個(gè)氨基酸組成。Ｄａｎｅ顆粒的中心部位逡逑則是部分雙鏈和單鏈的環(huán)狀ＤＮＡ和依附在上面的ＤＮＡ聚合酶。第二種顆粒為小圓球逡逑顆粒，直徑２２邋ｎｍ，是ＨＢｓＡｇ的主要組分，在血清中大量存在。這類顆粒是屬于ＨＢＶ逡逑多余的衣殼蛋白
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R512.62;R181.3

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本文編號(hào)：2620070