【摘要】： 胃腸動力障礙性疾病是一類常見的消化道疾病,其中糖尿病(diabetes mellitus,DM)相關的胃腸動力障礙最常見,包括糖尿病胃輕癱(Diabetic gastroparesis,DGP)及結腸動力障礙,嚴重影響患者的生活質量和血糖的控制,機制不清。研究證實Cajal間質細胞(Interstitial cell of Cajal,ICC)的結構與功能異常在DM胃腸動力障礙中有重要作用;又發(fā)現(xiàn)DM動物胃腸干細胞因子(Stem cell factor,SCF)與ICC病變密切有關,給予外源性SCF可改善或逆轉DM小鼠ICC病變及相關的胃腸運動障礙;另有研究發(fā)現(xiàn)外源性胰島素樣生長因子1(Insulin-like growth factor 1,IGF-1)對ICC具有保護作用,推測IGF-1可能通過胃腸平滑肌細胞(Smooth muscle cell,SMC)調控SCF的合成,間接影響ICC的存活。本研究從細胞水平探討IGF-1對胃腸SMC表達SCF的影響,并初步探討其分子機制。 [目的] 1.探討IGF-1對胃腸SMC合成SCF的影響。 2.探討IGF-1Rα抗體對胃腸SMC合成SCF的影響。 3.探討IGF-1調節(jié)胃腸SMC合成SCF的分子機制。 [方法] 1.大鼠胃和結腸SMC分離、培養(yǎng)與鑒定:正常SD大鼠斷椎處死,無菌條件下取胃和結腸組織、酶解法分離胃和結腸SMC。用含10%胎牛血清的DMEM液進行胃、結腸SMC的原代培養(yǎng)及傳代、α-actin免疫熒光法鑒定。 2.大鼠胃和結腸SMC+IGF-1:①不同濃度IGF-1(0,5,10,50,100,150μg/L)培養(yǎng)16h;②100μg/L的IGF-1培養(yǎng)不同時間(0h,8h,16h,24h,48h)。以Western blot法、RT-PCR法檢測SMC中SCF的變化。 3.胃和結腸SMC同時加入IGF-1(100μg/L)和不同濃度的IGF-1Rα抗體(0,50,100,150μg/L)培養(yǎng)16h。Western blot法、RT-PCR法檢測SMC中SCF的變化。 4.用PI3K抑制劑LY-294002、MEK1抑制劑PD98059分別預處理胃和結腸SMC1h后,再加入IGF-1(100μg/L)誘導16h。Western blot法、RT-PCR法檢測SMC中SCF的變化。 [結果] 1.大鼠胃和結腸SMC培養(yǎng)和鑒定:SMC培養(yǎng)24h后,可見SMC貼壁,呈三角形或梭形,有少量突起;3-5d后SMC開始增殖;14d后SMC密集,呈峰谷樣生長。α-actin免疫熒光陽性反應:大部分多角形細胞胞漿內見紅色熒光,細胞核Hoechst染色呈藍色。 2.不同濃度IGF-1對胃和結腸SMC表達SCF的影響:胃腸SMC在無血清培養(yǎng)時,SCF蛋白和mRNA表達較少。低濃度IGF-1(5,10μg/L)對SMC中SCF蛋白和mRNA表達無影響(P0.05),IGF-1在50μg/L時,SCF表達增加(P0.05),在100μg/L時表達最多(P0.05),150μg/L時結果類似100μg/L。 3.IGF-1作用時間對胃和結腸SMC表達SCF的影響:IGF-1在100μg/L時,促進SMC內SCF蛋白和mRNA的表達呈時間依賴性升高,16h達最高(P0.05),此后逐漸下降;48h與0h對SCF作用無統(tǒng)計學差異(P0.05)。 4.不同濃度的IGF-1Rα抗體對IGF-1誘導SCF的影響:加入IGF-1(100μg/L)與不同濃度的IGF-1Rα抗體后,隨抗體濃度的增高,SCF蛋白和mRNA的表達愈加減少,各濃度組之間有統(tǒng)計學差異(P0.05)。 5.PD-98059和LY-294002對IGF-1誘導的SCF蛋白及mRNA的影響:經過PD-98059預處理后,加入IGF-1(100μg/L),能顯著抑制SCF蛋白和mRNA表達(P0.05)。經過LY-294002預處理后,加入IGF-1(100μg/L),對SCF蛋白和mRNA表達無影響(P0.05)。 [結論] 1.IGF-1能誘導胃和結腸SMC中SCF表達增加,并具有時間、劑量依賴性。離體實驗中100μg/L可能是IGF-1促進胃腸SMC合成SCF的有效終濃度,且誘導16小時使SCF合成達到高峰。 2.IGF-1Rα抗體可抑制胃和結腸SMC中SCF的合成,抑制作用呈濃度依賴性。 3.IGF-1誘導SCF的表達可能依賴于ERKMAPK信號傳導通路。
【圖文】：

（一）胃和結腸SMC培養(yǎng)和免疫熒光鑒定1．細胞形態(tài)學：倒置顯微鏡下，胃和結腸SMC培養(yǎng)24h后，可見細胞貼壁，呈三角形或梭形，有少量突起；3～5d細胞開始增殖（見圖1）；14d后細胞密集，，呈峰谷樣生長（見圖2）。2．細胞免疫熒光法：大部分多角形細胞胞漿內見紅色熒光，α-actin 免疫熒光陽性反應，細胞核 Hoechst 染色呈藍色（見圖 3）。1 2圖 1 胃和結腸 SMC 培養(yǎng) 3-5 天（倒置顯微鏡×100）注：1. 胃 SMC；2. 結腸 SMC

1．細胞形態(tài)學：倒置顯微鏡下，胃和結腸SMC培養(yǎng)24h后，可見細胞貼壁，呈三角形或梭形，有少量突起；3～5d細胞開始增殖（見圖1）；14d后細胞密集，呈峰谷樣生長（見圖2）。2．細胞免疫熒光法：大部分多角形細胞胞漿內見紅色熒光，α-actin 免疫熒光陽性反應，細胞核 Hoechst 染色呈藍色（見圖 3）。1 2圖 1 胃和結腸 SMC 培養(yǎng) 3-5 天（倒置顯微鏡×100）注：1. 胃 SMC；2. 結腸 SMC
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R57

【參考文獻】

相關期刊論文 前8條

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本文編號：2619818