【摘要】： 目的肝纖維化是一個細胞外基質(zhì)沉積和降解失衡的病理過程;活化的肝星狀細胞(HSC)能分泌各種細胞因子如轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)等,通過旁分泌和自分泌的形式進一步激活HSC,活化的HSC具有了收縮、增殖和分泌大量的細胞外基質(zhì)(ECM)包括膠原,層粘連蛋白、蛋白聚糖等的功能;與此同時,分泌的能降解ECM的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)減少,而其抑制劑(TIMPs)增多,因此,HSC成為肝纖維化的中心環(huán)節(jié)。纖維化是可以逆轉(zhuǎn)的。那么如何逆轉(zhuǎn)肝纖維化成為我們迫切要解決的問題。越來越多的研究表明:通過凋亡形式清除活化的HSC是逆轉(zhuǎn)肝纖維化的關(guān)鍵。誘導(dǎo)凋亡的途徑很多:如基質(zhì)金屬蛋白酶9 (MMP-9),I型膠原的降解均可誘導(dǎo)HSC凋亡。因此,我們設(shè)想:如果MMPs增多,TIMP-1減少,膠原降解,一則可以促進HSC凋亡;二則也可以降解多余的ECM,減輕纖維化程度。所以研究HSC凋亡后ECM是如何代謝的成為該設(shè)想的前提條件。 方法含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)HSC-T6,傳代后換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分成對照組和模型組:對照組,N1:即正常HSC-T6,8小時后收獲;N2:正常HSC-T6,24小時收獲;N3:正常HSC-T6培養(yǎng)8小時后,更換新鮮的DMEM培養(yǎng)基,24小時收獲細胞。模型組,M1:加入濃度為100nmol/LH2O2, 8小時收獲細胞;M2:加入濃度為100nmol/LH2O2, 24小時收獲細胞; M3 :加入濃度為100nmol/LH2O2, 8小時后更換新鮮的DMEM培養(yǎng)基,24小時收獲細胞。利用Anexin V-FITC/PI染色流式細胞術(shù)檢測HSC凋亡。 檢測不同凋亡程度時TIMPs、MMPs、及膠原的改變。在實驗中,我們選取了3組不同凋亡水平的細胞(5%、58%、71%,編號為A、B、C);利用半定量RT-PCR測定TIMP-1、TIMP-2、MMP-2、MMP-9、COLⅠ、COLⅢ在mRNA水平的表達,利用western檢測細胞內(nèi)TIMP-1蛋白量的表達,利用明膠酶譜分析MMP-2、MMP-9在細胞內(nèi)和細胞外的蛋白水平表達。 結(jié)果三個對照組收獲細胞的凋亡率分別是5.56%、13.75%、12.58%;三個模型組的凋亡率分別是35.78%、;71.98%、57.55%。 對不同凋亡程度時,TIMPs、MMPs、及膠原改變的研究表明:TIMP-1的含量BAC;TIMP-2 A≈BC;MMP-2 B≈CA;MMP9 B≈CA;COLⅠABC;COLⅢABC;且COLⅠ的變化梯度 COLⅢ; 討論在HSC-T6自然凋亡過程中,N1與N2組,N1與N3組凋亡率的差別均有統(tǒng)計學(xué)意義;但N2與N3凋亡率的差別無統(tǒng)計學(xué)意義;因此我們推斷:HSC-T6在培養(yǎng)過程中,凋亡率隨著時間增加而增加,而更換新鮮培養(yǎng)基(減少ECM、TIMPs、MMPs對HSC的影響)對凋亡無影響。 加入H2O2誘導(dǎo)HSC-T6凋亡后,M1、M2、M3三組凋亡率的差別兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)意義。即更換新鮮培養(yǎng)基(減少ECM、TIMPs、MMPs對HSC的影響)能抑制H2O2誘導(dǎo)的HSC凋亡。對于此現(xiàn)象,我們有三個可能推斷:第一:MMPs誘導(dǎo)HSC凋亡的能力大于TIMPs抑制凋亡的能力;第二:MMPs的絕對數(shù)量大于TIMPs;第三:其他因素的影響如COLⅠ降解促進凋亡等。由此,我們得出結(jié)論:ECM、TIMPs、MMPs的改變對H2O2誘導(dǎo)的HSC凋亡有影響。 對不同凋亡水平時ECM的代謝變化研究表明:凋亡早期:TIMP-1上升明顯,COLⅠCOLⅢ高表達,MMP-2、MMP-9相對較少,而且隨著HSC凋亡數(shù)量增加又反過來刺激TIMP-1的升高;進而抑制MMP-2、MMP-9的分泌以及膠原的降解,此時HSC抗凋亡能力較強。凋亡晚期:TIMP-1、COLⅠ、COLⅢ的表達也急劇減少,而MMP-2、MMP-9表達增高,因此在凋亡后期促凋亡能力大大增加。TIMP-2整個過程中的表達較低,改變不明顯。 綜上所述,我們看出膠原、MMPs、TIMP-1在整個凋亡過程中起著重要的作用。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R575.2

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

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本文編號：2615010