【摘要】：microRNA(miRNA)是一類長度約20～24 nt的非編碼單鏈小分子RNA,它們通過與目標mRNA分子的3’非翻譯區(qū)(3'-untranslated region,3'-UTR)互補匹配導致該mRNA分子的翻譯受到抑制或影響其穩(wěn)定性,從而調控下游的生物學過程。近年來,除了對microRNA產生的剪接機制和下游功能展開了深入而廣泛的研究,對于microRNA初始轉錄本生成的轉錄調控研究也是方興未艾。 人miR-122是我們所關注的一個肝臟特異性小RNA。它的初始轉錄本來源于人18號染色體上hcr基因的轉錄,其成熟本在進化過程中高度保守。miR-122在肝臟發(fā)育過程中持續(xù)表達,且隨肝臟細胞的分化成熟表達增高。研究表明：在病理狀態(tài)下,miR-122促進丙型肝炎病毒(HCV)在肝細胞內復制,并與肝細胞肝癌(HCC)的發(fā)生、發(fā)展及轉移等過程密切相關；在生理狀態(tài)下,miR-122參與肝細胞表型,肝臟的分化,發(fā)育與代謝,以及肝細胞應急應答等基本生命活動過程。miR-122的沉默可導致小鼠血漿膽固醇和甘油三酯水平的顯著降低,說明miR-122是肝臟脂肪代謝的重要調控者。 FOXO1是哺乳動物叉頭蛋白家族O亞族四個成員之一。叉頭蛋白家族中,特別是FOXO1在整個機體的能量代謝中起著至關重要的作用。在饑餓狀態(tài)下,肝臟通過FOXO1在促進糖異生酶類表達中的關鍵作用維持血糖的水平。而在進食后,胰島素分泌增加,通過PI3K-Akt途徑磷酸化FOXO1使其出核,部分抑制糖異生酶類在肝臟中的表達。除了直接調控代謝,FOXO1還在骨骼肌和脂肪組織這兩大維系能量穩(wěn)態(tài)平衡的主要器官的形成過程中起重要作用。另外,FOXO1的表達可促進抗氧化應激的基因表達,從而起到細胞保護功能。FOXO1也能促進碳水化合物向脂肪酸的轉換,使其在饑餓狀態(tài)下成為主要的能量來源。 本研究旨在探索糖脂代謝重要因子FOXO1對miR-122的轉錄調控作用及其調控機制。首先,我們利用UCSC網站和ECR browser等在線分析軟件對miR-122成熟本上游5kb的片段進行生物信息學的分析,發(fā)現在之前本室鑒定的miR-122核心啟動子區(qū)存在一個FOXO1的保守結合位點。然后利用瞬時轉染和篩選穩(wěn)定克隆兩種辦法將FOXO1的野生型表達質粒FOXO1-WT和有著三個磷酸化位點突變的核內組成型表達質粒FOXO1-CA及空載體對照在肝細胞系Huh7中表達,發(fā)現野生型FOXO1蛋白對miR-122的轉錄呈現正調控模式,而核內組成型表達的FOXO1蛋白對miR-122的轉錄呈現負調控模式。接著,運用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)確定了FOXO1對miR-122上游啟動子區(qū)存在轉錄調控作用,并利用miR-122上游調控區(qū)的片段截短和突變實驗來確定了FOXO1調控miR-122轉錄的具體位點是miR-122核心啟動子區(qū)的IRE(胰島素應答元件)元件。最后,我們利用鑒定轉錄因子的經典方法凝膠遷移速率實驗(EMSA)和染色質免疫共沉淀實驗(ChIP)分別從體外和體內進一步確定了FOXO1可以直接結合于miR-122核心啟動子區(qū)的IRE位點。同時發(fā)現FOXO1的這種結合在血清剝奪后的低營養(yǎng)狀態(tài)下增強而在回復血清后的高營養(yǎng)狀態(tài)下減弱,并且它與HNF4對該IRE位點的結合是競爭性的。 綜上所述,我們的研究首次發(fā)現FOXO1可作為miR-122的轉錄因子,通過結合到miR-122核心啟動子區(qū)的IRE位點來調控miR-122初始轉錄本的轉錄。這種結合受營養(yǎng)狀態(tài)密切相關的信號通路的影響,同時也受到HNF4對該位點結合的競爭,可最終參與到肝臟脂代謝的精細調控過程中。
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R575

【同被引文獻】

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1 范春光;王春梅;王燕;李麗;孫汶生;劉玉剛;李瑞峰;;miR-122表達載體的構建及其對HepG2.2.15細胞增殖的抑制作用[J];山東大學學報(醫(yī)學版);2011年10期

2 李蘇娟;陳智;朱海紅;;miR-122對IFN-α抗HCV效應的影響[J];浙江大學學報(醫(yī)學版);2011年06期

相關碩士學位論文 前1條

1 郝美君;miR-122對HBV調節(jié)作用的研究[D];重慶醫(yī)科大學;2009年

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本文編號：2606875