【摘要】：[研究背景] 非可控性炎癥在腫瘤的啟動、促進與進展中發(fā)揮重要作用。結直腸癌是世界第三大癌,嚴重威脅人類健康。非可控性的結腸炎癥,如潰瘍性結腸炎,可顯著增加罹患結直腸癌的風險,且結直腸癌的發(fā)生與炎癥的嚴重程度、范圍等因素呈正相關。結腸炎相關性癌與傳統(tǒng)意義上的結直腸癌相似,為一涉及多基因、多步驟、多階段的復雜過程。而與經(jīng)典結直腸癌的“腺瘤-腺癌”序列不同,潰瘍性結腸炎發(fā)展至結直腸癌經(jīng)歷了“炎癥-不典型增生-癌癥”的序列演進。目前對潰瘍性結腸炎相關性結直腸癌發(fā)病機制的研究才剛剛起步,尚缺乏針對連續(xù)病變階段的動態(tài)組學研究,對其分子機制及其調控網(wǎng)絡的認知也不全面。為從全基因組轉錄水平與蛋白表達水平兩個層面全面、深入地探討“炎-癌鏈”中的分子事件及其交互作用網(wǎng)絡,本研究在構建化學誘導的非可控性結腸炎及其相關性結直腸癌的小鼠模型基礎上,采用全基因組表達譜基因芯片技術結合生物信息學分析、炎癥因子抗體芯片(蛋白芯片)技術、實時定量PCR以及免疫組織化學法,對“炎癥-不典型增生-癌癥”序列演進過程的轉錄組及“炎-癌”調控網(wǎng)絡中的關鍵信號通路與分子的動態(tài)變化規(guī)律進行分析歸納,旨在為非可控性結腸炎及其相關性結直腸癌的發(fā)病機制和臨床診治提供理論依據(jù)。 [非可控性結腸炎及結腸炎相關性結直腸癌小鼠模型的構建] 通過單次小劑量地腹腔注射誘變劑氧化偶氮甲烷,1周后予以循環(huán)飲用致炎劑葡聚糖硫酸鈉,我們成功構建非可控性結腸炎及其相關性癌小鼠模型。該模型具有與人類潰瘍性結腸炎及其相關性癌相似的特征：(1)臨床表現(xiàn)上均有腹瀉、大便隱血、粘液膿血便、體重不增或下降。(2)病理學觀察,給予葡聚糖硫酸鈉后小鼠結直腸出現(xiàn)明顯的炎癥反應,大量炎性細胞浸潤,糜爛與淺潰瘍從大腸遠端向近端發(fā)展；隨著葡聚糖硫酸鈉的循環(huán)飲用,形成非可控性的慢性腸道炎癥,疾病進展呈現(xiàn)典型的“炎癥-不典型增生-腺癌”的序列演進過程；不典型增生以扁平型為主,不典型增生與癌呈多灶性,且發(fā)生于炎癥較重的部位。(3)小鼠模型與人類潰瘍性結腸炎及結腸炎相關性癌有相似的表達譜特征。以上發(fā)現(xiàn)證實該模型可較好地模擬人類潰瘍性結腸炎與炎癥相關性癌,有科學應用價值,可為后續(xù)試驗提供保障。 [非可控性結腸炎癌變過程的轉錄組動態(tài)變化規(guī)律] 轉錄水平的變化是基因組遺傳信息的集中體現(xiàn),為了全面地揭示潰瘍性結腸炎相關性結直腸癌病變各階段轉錄組的動態(tài)變化規(guī)律,本研究選取“正常-炎癥-不典型增生-腺癌”各病理階段的小鼠腸道黏膜進行全基因組表達譜芯片分析。研究發(fā)現(xiàn),各病理階段的基因表達呈現(xiàn)一定的規(guī)律性,尤以早期炎癥期的分子變化最為顯著,分別有2245與2294個基因探針在炎癥組織中較正常組織發(fā)生了上調與下調,形成一陣“轉錄風暴”。多種聚類分析顯示炎癥期的樣本嚴格聚為一類,在主成分中占有絕對地位。對基因注釋本體(GO)的富集度網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn),該時期變化最顯著的為炎癥相關基因集,包括直接參與炎癥反應的細胞因子、趨化炎癥細胞的趨化因子、誘導白細胞粘附的粘附分子、參與組織修復的血管生成因子與基質重建因子、誘導壞死細胞凋亡及促進腸上皮細胞存活與增殖的因子等等,而這些基因集在不典型增生及癌癥期表達趨于緩和,表明機體在早期處于積極地防御狀態(tài),而至后期,機體逐漸對炎癥與腫瘤細胞產(chǎn)生耐受,轉錄水平改變趨緩；也提示腫瘤微環(huán)境對免疫細胞的改造作用。這種早期的劇變可能已經(jīng)決定了細胞的命運與疾病的走向。在癌癥期,仍有部分炎癥因子的活躍,主要是促進細胞增殖、抑制凋亡、促進血管新生與基質降解的基因表達上調,充分體現(xiàn)出結直腸癌的惡性行為特征。 [信號通路的階段性活化是連接“炎-癌”的紐帶] 經(jīng)基因表達譜芯片的生物信息學分析及免疫組化驗證,本研究發(fā)現(xiàn)NF-κB、STAT3、p38MAPK及Wnt/β-catenin等信號轉導通路在CAC進程中存在階段性活化。其中NF-κB經(jīng)典途徑(p65)與STAT3兩條信號通路在“炎癥-不典型增生-癌”的序列演進中呈現(xiàn)持續(xù)性活化,p65、磷酸化STAT3(p-STAT3)及其靶基因編碼蛋白Bcl-xL、COX-2的表達均呈逐級升高的趨勢；NF-κB旁路途徑(p52)僅在炎癥細胞中活化,且在炎癥期最為活躍,而不典型增生期至癌癥期表達逐漸下調；p38MAPK信號的活化發(fā)生于炎癥期及不典型增生期；在腫瘤形成階段p38MAPK失活,而Wnt/β-catenin通路開始處于明顯活化狀態(tài)。這些結果表明,NF-κB經(jīng)典途徑與旁路途徑、STAT3及p38MAPK可能對炎癥的啟動和維持具有重要作用,參與炎癥細胞的趨化、促炎因子的釋放；而NF-κB經(jīng)典途徑、STAT3及p38MAPK誘導的持續(xù)性炎癥反應又對腸上皮細胞的惡性轉化產(chǎn)生積極作用,微環(huán)境當中的細胞中上述信號的激活導致細胞因子的持續(xù)產(chǎn)生,繼續(xù)作用于轉化細胞,促進其存活與生長；隨著Wnt/β-catenin通路的激活與p38MAPK的失活(p38MAPK被認為是抑瘤基因),促瘤與抑瘤的平衡終于被打破,在NF-κB經(jīng)典途徑與STAT3信號所營造的炎性背景下,腫瘤穩(wěn)定形成與進展。 [非可控性結腸炎癌變過程動態(tài)交互作用網(wǎng)絡的關鍵節(jié)點] 結合表達譜芯片數(shù)據(jù)分析及血清炎癥因子芯片的檢測結果,我們找到非可控性結腸炎癌變過程各病變階段的交互作用網(wǎng)絡關鍵節(jié)點。炎癥期,IL-1p、IL-6、COX-2及CEBPB位于上調的分子網(wǎng)絡中心,CYP家族成員、緊密連接蛋白occludin與肝細胞核因子4α位于下調的分子網(wǎng)絡中心；不典型增生期,上調分子網(wǎng)絡的關鍵節(jié)點為CD44和VCAM-1,下調分子網(wǎng)絡的關鍵節(jié)點為CYP家族和GSTM家族成員；癌癥期,上調分子網(wǎng)絡的關鍵節(jié)點包括IL-23a、CXCL2、IL-1β、 LCN2、TIMP1、MMPs、TCF2等,下調分子網(wǎng)絡的關鍵節(jié)點則由CYP家族與ALDH家族成員組成。這些關鍵分子與眾多的差異分子發(fā)生交互作用,并與NF-κB、STAT3、p38MAPK及Wnt/β-catenin等信號通路緊密相聯(lián),形成特色的階段性的動態(tài)調控網(wǎng)絡,推動非可控性炎癥介導的惡性轉化。 綜上所述,利用小鼠模型研究“非可控性結腸炎-不典型增生-結直腸癌”序列演進過程中不同病理階段轉錄組變化規(guī)律,并在蛋白水平進行初步驗證,為我們進一步探索相關分子機制及其調控網(wǎng)絡提供了有價值的理論和實驗依據(jù)。本研究通過高通量的全基因組表達譜芯片分析發(fā)現(xiàn)了基因組的動態(tài)轉錄規(guī)律,在炎癥早期形成的轉錄風暴似乎決定了疾病的走向,通過生物信息學分析和免疫組化驗證,首次報道了NF-κB、STAT3、p38MAPK及Wnt/β-catenin等關鍵信號通路的階段性活化規(guī)律；而對血清炎癥因子芯片的篩查則對上述結論提供了更有力的支撐。這說明在炎-癌演進的多階段過程中,關鍵信號通路及其下游靶基因的階段性活化發(fā)揮主要推動作用。盡管小鼠與人類的同源性很高,對研究結論的推廣尚需進行大量臨床樣本的驗證。將人類疾病樣本數(shù)據(jù)與動物模型數(shù)據(jù)進行整合,有望為臨床上對潰瘍性結腸炎及其相關性結直腸癌的早期診治提供新的思路；并提示醫(yī)務工作者應高度重視對慢性炎癥的預防與治療,阻止炎癥的惡性轉化。
【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R574.62

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 李曉寧;陳姪;;潰瘍性結直腸炎與結直腸癌的相關性[J];中國中西醫(yī)結合消化雜志;2008年06期

，

本文編號：2605843