【摘要】：肝臟承擔著機體物質代謝和生物轉化的功能,血液供應豐富,因此肝臟易受到體內外的各種病原和刺激因子的侵襲,引起肝臟損害與炎癥反應。肝臟長時期處于損傷狀態(tài),往往會導致肝纖維化的發(fā)生。肝纖維化(hepatic fibrosis,HF)是肝臟自我防護的損傷-修復反應,是一種漸進的病理過程。其疾病特征是以膠原為主的細胞外基質(extracellular matrix,ECM)在肝內沉積,造成肝小葉結構改建、假小葉和結節(jié)形成,嚴重的肝纖維化可以發(fā)展為肝硬化,甚至肝癌。近年來研究發(fā)現,肝纖維化在去除了損傷因素后是可以逆轉恢復的,表現為沉積的膠原降解,肝臟結構和肝臟功能的恢復。而肝星狀細胞(hepatic stellate cell, HSC)增殖在肝纖維化形成過程中起關鍵作用因此,減少肝星狀細胞的增殖成為阻止肝纖維化進程的途徑之一。文獻表明,在肝纖維化形成階段瘦素(Leptin)及其受體(OB-Rb)的表達逐漸增加,可通過直接與星狀細胞膜OB-Rb結合激活星狀細胞,亦或與枯否細胞膜OB-Rb結合,激活枯否細胞促進轉化生長因子β1(TGF-β1)等促纖維化細胞因子的分泌,進而促進肝星狀細胞增殖,在肝纖維化形成過程中發(fā)揮了重要的作用。但是在肝纖維化逆轉恢復期,瘦素及其受體的表達變化以及這種變化對肝星狀細胞的增殖和細胞因子TGF-β1會產生的影響未見文獻報道。 為此,本研究選用四氯化碳(CCl4)誘導的大鼠肝纖維化逆轉恢復模型,觀察肝纖維化逆轉的不同時期瘦素及其受體的變化,探討該變化與肝纖維化逆轉的相關關系以及對可能的影響機制。研究內容主要包括以下兩個部分: 1、Leptin及TGF-β1與CCl4誘導大鼠肝纖維化模型逆轉恢復的相關性研究 CCl4是經典的肝纖維化誘導劑,可直接損傷肝細胞,通過炎癥細胞集聚、釋放細胞因子觸發(fā)間質組織的過量產生,誘導大鼠形成肝纖維化;去除CCl4刺激后,肝臟炎癥、肝細胞變性和壞死減輕,纖維化程度減輕,肝纖維化自然逆轉恢復,這一過程可能與多種因素有關,但具體機制尚未明了。本研究采用SD大鼠背部皮下注射CCl412周,形成肝纖維化化,分別于停注后0周、2周、4周、6周、8周處死實驗動物,動態(tài)觀察肝組織病理和肝纖維化指標的變化,結果顯示停注CCl4后大鼠肝組織病理逐漸減輕,肝指數、肝臟谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、透明質酸(HA)、Ⅳ型膠原(CⅣ)和羥脯氨酸(Hyp)亦不斷降低,至逆轉恢復4周時,各項指標與正常組,比較無顯著性差異,肝纖維化逆轉恢復。研究結果與文獻報道一致,證明本實驗成功建立大鼠肝纖維化逆轉恢復模型,為下一步研究奠定了基礎。 Leptin及TGF-β1在肝纖維化形成過程中具有重要的作用。Leptin是肝纖維化的始動因素之一,可與HSC、枯否細胞上表達的OB-Rb結合,經過細胞內信號通路,激活肝星狀細胞和促肝維化細胞因子分泌,促進肝纖維化發(fā)展。TGF-β1對纖維化時形成的細胞外基質具有重要調控作用,與TGF-βRⅠ結合后激活HSC內Smad信號通路,促進HSC增殖,調節(jié)ECM合成與沉積。本研究觀察到在肝纖維化自然逆轉恢復過程中,血清及組織Leptin和TGF-β1在恢復0w時表達顯著增高,經過2、4、6、8w恢復后逐漸降低,其下降趨勢與肝纖維化血清及組織學指標HA、CⅣ、Hyp變化呈顯著正相關(P0.01),表明Leptin及TGF-β1下降對肝纖維化逆轉恢復具有重要作用。進一步檢測OB-Rb和TGF-βRⅠmRNA表達,結果顯示在肝纖維化逆轉恢復過程中,受體表達逐漸下調;同時檢測核轉錄因子-κb(NF-κb)的蛋白表達變化,亦出現相同趨勢。因此,Leptin及TGF-β1水平的下降,使OB-Rb和TGF-βRⅠ表達下調,影響了NF-κb激活,可能是影響肝纖維化逆轉恢復的機制之一。 2、JAK/STAT信號通路在肝纖維化逆轉恢復期肝星狀細胞的變化及瘦素對轉化生長因子β1分泌的影響 JAK-STAT通路是瘦素的主要信號轉導途徑,瘦素與其受體OB-Rb結合可引起JAK1、JAK2及受體胞質區(qū)磷酸化,并進一步使下游胞質蛋白STAT磷酸化,STAT磷酸化后轉核內,調控相應基因的表達。文獻表明,JAK-STAT通路的激活對HSC活化增殖以及各種促纖維化細胞因子的分泌具有重要調控作用。然而在肝纖維化逆轉恢復期,該通路各蛋白的表達變化情況未見文獻報道。本部分研究中,我們采用肝臟原位灌流、密度梯度離心的方法分離得到正常組、逆轉恢復0周、逆轉恢復4周組大鼠HSC,觀察OB-Rb、JAK-STAT通路蛋白變化情況。同時選擇瘦素對HSC的最佳刺激濃度,觀察TGF-β1分泌。結果顯示,肝纖維化逆轉恢復4周組大鼠HSC上OB-Rb表達較低,JAK、STAT磷酸化程度較逆轉恢復0周組顯著降低。100ng·mL-1為瘦素最佳刺激濃度,作用于HSC后,TGF-β1蛋白分泌較正常對照組顯著升高;Leptin+AG490(JAK蛋白特異性阻滯劑)作用HSC后僅檢測到少量的TGF-β1,與正常對照組差異無統(tǒng)計學意義�？梢奐AK-STAT通路是Leptin調節(jié)TGF-β1分泌的重要途徑。因此,在肝纖維化逆轉恢復期,體內瘦素水平的降低,OB-Rb蛋白表達下調, JAK/STAT信號途徑活化程度降低,使TGF-β1分泌減少,進而減輕對HSC的刺激,從而對肝纖維化的逆轉恢復產生影響。
【圖文】：

圖 1 肝組織切片 HE 染色 ×200Fig 1 Photomicrographs of liver sections stained with HE trichrome(original magnification×200 )l；B： 0wk spontaneous recovery；C： 2wk spontaneous recovery；D： 4wk spery；E： 6 wk spontaneous recovery；F： 8 wk spontaneous recovery；B：恢復 0 周組；C：恢復 2 周組；D：恢復 4 周組；E：恢復 6 周組；誘導大鼠肝纖維化模型逆轉恢復肝膠原檢查動態(tài)變化（Masson）son 染色結果顯示：正常大鼠肝組織結構清晰，肝小葉結構正常，，，排列整齊，肝細胞完整，無異常纖維增生，匯管區(qū)無纖維組織 12wk 的大鼠有較多的成纖維細胞出現，纖維結締組織增生，增多線條狀纖維間隔，分割肝小葉，使小葉結構破壞，肝索排列紊亂

圖 2 肝組織切片 Masson 染色 ×200ig2 Photomicrographs of liver sections stained wkith Masson’s trichrome st(original magnification×200 )trol；B： 0wk spontaneous recovery；C： 2wk spontaneous recovery；D： 4wkovery；E： 6 wk spontaneous recovery；F： 8 wk spontaneous recovery組；B：恢復 0 周組；C：恢復 2 周組；D：恢復 4 周組；E：恢復 6 周組組l4誘導大鼠肝纖維化模型逆轉恢復肝臟指數的動態(tài)變化指數是反映肝臟炎癥和脂肪變性程度的重要指標之一。結果顯示相比， CCl4注射 12wk 模型大鼠體重均明顯減輕，肝臟指數均.01）；在停止注射 CCl4經 2wk、4wk、6wk 和 8wk 的逆轉恢復，各明顯增加，肝臟指數顯著下降。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R575.2

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