【摘要】：[研究背景] 乙型病毒性肝炎,簡稱乙肝,是一種由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)引起的世界范圍傳播的疾病。乙型肝炎主要通過與被感染的人的血液和其它體液的接觸傳染。HBV感染是引起慢性肝病、肝硬化、肝細胞肝癌的主要原因。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道,全世界有20億人感染過HBV,其中3.6億以上為慢性感染,每年大約有60萬人死于HBV感染的相關性肝病及肝細胞肝癌。注射對抗HBV感染的疫苗是目前有效預防HBV的最佳手段,但是仍然不能阻止HBV的傳播。HBV自然感染的宿主范圍狹窄,只局限于人類和大猩猩,因此目前HBV的研究缺少合適的動物模型,HBV的研究更多的依賴于細胞模型。HBV DNA轉(zhuǎn)染的肝癌細胞系是體外研究HBV的結構與功能、基因表達與調(diào)控,以及藥物篩選及耐藥機制的有力工具,然而病毒進入肝癌細胞系的方式不是正常的感染而是轉(zhuǎn)染或者整合,因此肝癌細胞系不能用于研究早期病毒-靶細胞的相互作用(例如病毒的吸附,穿入、脫衣殼等)。原代人肝細胞對HBV有著天然的易感性,但是來源有限(新鮮的肝臟組織),體外培養(yǎng)困難(不能傳代、肝細胞特殊形態(tài)不能維持)等缺點限制了其做為細胞模型的可能。最近幾年,與肝細胞相關的干細胞因為其強大的增殖能力和固有的生物學特性引起了人們的重視,肝細胞起源于骨髓細胞,骨髓細胞被視為肝細胞再生的重要源泉。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone-marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)在特殊的誘導條件下體外能夠誘導成具有肝功能的成熟的類肝細胞,動物模型顯示移植入體內(nèi)的誘導前或者誘導后的BMSCs均能恢復受損的肝細胞。但是人BMSCs是否對HBV易感,是否能成為研究HBV的細胞模型目前尚未有報道。本研究用HBV體外自然感染人BMSCs,探討人BMSCs做為細胞模型研究HBV最初生命過程、HBV生物學特性、HBV與宿主細胞相互作用的早期機制及HBV耐藥機制的可能性。 本研究分為2個部分： 第一部分人骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)和純化 [目的] 探討從人骨髓中分離、培養(yǎng)、純化、擴增BMSCs的方法,建立穩(wěn)定的人BMSCs,為后續(xù)HBV研究提供可靠的細胞模型。 [方法] 1.密度梯度離心法結合貼壁篩選法及酶消化控制法分離、培養(yǎng)、純化人BMSCs。 2.觀察人BMSCs的細胞形態(tài)學特點,繪制人BMSCs(P5)的生長曲線,計算細胞對數(shù)生長期倍增時間。 3.流式細胞術檢測人BMSCs(P5)的群體DNA含量分布(細胞周期),常見的表面標志物。 4.評估人BMSCs的傳代、凍存和復蘇的能力。 [結果] 1.成功分離培養(yǎng)了人BMSCs。細胞貼壁生長,形態(tài)均一,以梭形為主,邊界清晰,胞核飽滿居中,多成橢圓形,細胞排列具有一定方向性,密度高時成漩渦狀或放射狀排列。 2.人BMSCs生長增殖旺盛,體外能長期培養(yǎng)擴增,生長曲線呈典型的“S”型,細胞對數(shù)生長期倍增時間為31h。符合間充質(zhì)干細胞的特性。 3.流式細胞術示人BMSCs細胞周期大部分處于靜止期,小部分處于分裂周期,具有強大的增殖潛力；人BMSCs穩(wěn)定高表達CD90、CD105,不表達CD34、 CD45。符合間充質(zhì)干細胞的特性。 4.人BMSCs可凍存,復蘇后細胞形態(tài)學及生物學特性穩(wěn)定,細胞生長增殖旺盛。符合細胞模型的特點。 [結論] 體外培養(yǎng)的人BMSCs生長穩(wěn)定,增殖旺盛,能連續(xù)傳代,可用于進一步的組織工程、細胞模型和分子生物學研究。 第二部分乙肝病毒體外自然感染人骨髓間充質(zhì)干細胞 [目的] 評估HBV體外自然感染人BMSCs后的復制、合成、表達能力,探討人BMSCs做為細胞模型用于研究HBV的可能性。 [方法] 1. HBV DNA陽性(5.4×108copies/mL)的患者血清孵育培養(yǎng)的人BMSCs,感染細胞。 2.熒光定量PCR方法檢測HBV陽性血清孵育后的人BMSCs是否合成、分泌HBV DNA。 3.DNA印跡法(Southern blotting)檢測HBV是否在感染后的人BMSCs內(nèi)有效復制,形成復制中間體：共價閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA, cccDNA)。 4.電化學發(fā)光法檢測HBV陽性血清孵育后的人BMSCs是否表達、分泌乙肝病毒表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)。 5.間接免疫熒光方法檢測HBV陽性血清孵育后的人BMSCs是否合成、表達乙肝病毒核心抗原(HBcAg)。 6.阻斷實驗：將含10%的感染血清的雙無培養(yǎng)基加入不同稀釋度的抗HBsAg的特異性抗體按前述感染方法孵育人BMSCs檢測病毒進入細胞的途徑。 [結果] 1.HBV成功自然感染人BMSCs,感染后細胞形態(tài)學穩(wěn)定,生長增殖旺盛。 2.HBV陽性血清孵育后的第2天人BMSCs可以檢測到HBV DNA,第6-12天維持在相對高的水平,HBV DNA最高值為9.37×105copies/mL; HBV陽性血清孵育后的第3-15天BMSCs培養(yǎng)上清中可以檢測到HBV DNA, HBV DNA的含量分布在3.792×102copies/mL和4.067×105copies/mL之間。 3. Southern blotting檢測顯示人BMSCs在HBV陽性血清孵育后第2天就可檢測到HBV cccDNA的微弱信號(2.0kb),陽性信號隨著培養(yǎng)進程的推進而增強。 4.HBV陽性血清孵育后的人BMSCs能夠持續(xù)分泌HBsAg和HBeAg到培養(yǎng)上清中。感染后第2-16天培養(yǎng)上清中能檢測到HBsAg,最低值是1.612IU/mL,最高值是118.100IU/mL;感染后第5-13天培養(yǎng)上清中能檢測到HBeAg呈陽性表達；HBeAg檢測最低值是0.115s/co (absorbance rate/cut-off ratio),最高值是3.407s/co (≥1s/co為陽性)。 5.HBV陽性血清孵育后的第2天開始人BMSCs可以檢測到HBcAg。間接免疫熒光染色表現(xiàn)為胞漿內(nèi)強烈的彌漫性著色,細胞核部分著色,大約7%的細胞核呈陽性表達,且數(shù)目隨著培養(yǎng)進程的推進而增多,第9天達高峰,大約20%的細胞核呈陽性表達。 6.抗HBsAg的抗體能夠阻斷HBV進入人BMSCs,阻斷率與抗HBsAg的抗體的濃度有明顯的量效關系。 [結論] 人BMSCs對HBV自然感染易感,能在病毒侵入后啟動有效的病毒復制,形成復制中間產(chǎn)物HBV-cccDNA,表達HBV特異性抗原并合成子代病毒顆粒分泌出細胞。人BMSCs可以作為細胞模型用于研究HBV自然感染,進行HBV感染宿主細胞的早期過程(粘附、穿入、脫衣殼)及機制的研究,進行病毒-靶細胞相互作用機制的研究。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R512.62

【參考文獻】

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1 謝金敏;陳建鋒;高毅;姚坤厚;;人骨髓間充質(zhì)干細胞體外分化為肝樣細胞的實驗研究[J];南方醫(yī)科大學學報;2006年10期

2 唐力軍,高毅,張志,李浩,單毓強;肝細胞生長因子聯(lián)合成纖維細胞生長因子-4誘導人骨髓來源的多能成體祖細胞向肝樣細胞分化[J];中華肝臟病雜志;2005年09期

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本文編號：2593032