本文關(guān)鍵詞：SIRT1通過調(diào)控鈣網(wǎng)蛋白CRT參與脂質(zhì)代謝的機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景及目的:近年來國人飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變導致代謝綜合征(Metabolic Syndrome,MS)和非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)的發(fā)病率逐年上升,嚴重影響國人健康。肝臟脂肪代謝紊亂是導致MS和NAFLD發(fā)生和發(fā)展的核心機制。因此,闡明肝臟脂肪代謝紊亂的病理機制和尋找干預靶點是當今醫(yī)學界的重大難題。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)去乙�；讣易遄钪匾某蓡T沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Silent information regulator 1,SIRT1)在人肝臟脂肪變細胞中表達明顯下降,而SIRT1肝臟特異性敲除可引起明顯的肝臟脂肪變和糖異生障礙。以上結(jié)果提示SIRT1對肝臟糖脂代謝關(guān)鍵蛋白的去乙�；{(diào)控,并在脂質(zhì)代謝障礙中發(fā)揮尤為關(guān)鍵的作用。此外,SIRT1還可通過與眾多脂肪代謝的轉(zhuǎn)錄因子的相互作用,如PPARγ、PGC-1α、FOXO等調(diào)控脂肪代謝。目前在能量代謝領(lǐng)域,對肝臟脂肪代謝通路及相關(guān)分子的研究大多延續(xù)了30年前甚至更早發(fā)現(xiàn)的經(jīng)典分子,相關(guān)新分子發(fā)現(xiàn)及鑒定研究較為薄弱。在蛋白質(zhì)組學和功能基因組學日益成熟的今天,我們有條件和必要利用新的技術(shù)和手段探索肝臟脂肪代謝通路新的關(guān)鍵分子與通路。因此,本課題將聚焦SIRT1與肝臟脂肪代謝的關(guān)系,旨在尋找能夠影響脂肪代謝的新的關(guān)鍵蛋白。我們的研究可能為MS及NAFLD的治療提供重要的理論和潛在臨床應(yīng)用價值。方法:1、構(gòu)建兩種不同的肝臟脂肪變小鼠模型:肝臟特異性SIRT1敲除小鼠(SIRT1-LKO)和高脂飲食(HFD)喂養(yǎng)小鼠。通過q PCR、Western-Blot、免疫組化、HE染色等方法確認模型構(gòu)建。2、將實驗小鼠分為四組:CONTROL組,SIRT1-LKO組,HFD組,SIRT1-LKO+HFD組。運用i TRAQ-MS/MS和c DNA array技術(shù)分別篩選SIRT1相關(guān)差異蛋白和基因并鎖定興趣分子CRT。q RT-PCR和Western-Blot進行小鼠肝臟組織樣本中CRT表達驗證。3、CRT功能驗證。構(gòu)建CRT過表達及RNA干擾慢病毒載體,并分別轉(zhuǎn)入人胚胎肝細胞系(L02)及過表達SIRT1的L02細胞(L02-SIRT1)中。q RT-PCR和Western-Blot驗證CRT表達情況。建立油酸(oleic acid,OA)和棕櫚酸(palmitic acid,PA)刺激細胞脂肪變模型。高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)檢測CRT的表達和脂肪合成的關(guān)系。q RT-PCR檢測CRT高、低表達L02細胞系中FAS、SCD、Ch REBP、PPARα等糖脂代謝相關(guān)基因的表達情況。在同時過表達CRT和SIRT1的L02細胞(L02-SIRT1-CRT)中以免疫共沉淀法(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)檢測SIRT1和CRT之間是否存在蛋白間相互作用。結(jié)果:1、成功構(gòu)建兩種不同的肝臟脂肪變小鼠模型。我們證實了SIRT1-LKO小鼠中SIRT1肝臟特異性缺如。HE染色顯示SIRT1-LKO小鼠和HFD喂養(yǎng)小鼠均呈現(xiàn)肝臟組織明顯脂肪變。2、通過i TRAQ-MS/MS技術(shù)和c DNA array篩選出興趣蛋白CRT,CRT的m RNA水平不變而蛋白水平升高提示其可能受到蛋白翻譯后修飾。i TRAQ結(jié)果顯示與CONTROL組相比CRT蛋白在SIRT1-LKO組及HFD組分別升高1.49和1.18倍,在SIRT1-LKO+HFD組升高1.62倍。Western-Blot檢測發(fā)現(xiàn)SIRT1-LKO組及HFD組小鼠肝臟組織中CRT蛋白水平也升高,與i TRAQ結(jié)果相一致。c DNA array結(jié)果顯示CRT m RNA水平在SIRT1-LKO及HFD情況下均未發(fā)生明顯差異,q RT-PCR提示同一結(jié)果。3、在CRT高、低表達的L02細胞系中驗證CRT對脂肪合成的影響。構(gòu)建CRT過表達和RNA干擾慢病毒載體并經(jīng)雙酶切電泳及DNA測序驗證。q RT-PCR和Western-Blot證實CRT過表達及低表達細胞系構(gòu)建成功。油紅O和BODIPY染色證實OA和PA成功誘導脂肪變細胞模型。高內(nèi)涵檢測提示CRT過表達能夠抑制脂肪合成,而CRT低表達使細胞中脂滴合成增加。q RT-PCR結(jié)果顯示FAS、Ch REBP等促進脂肪合成的基因在CRT高表達細胞系中降低,而在CRT低表達時升高。Co-IP結(jié)果提示SIRT1和CRT之間存在蛋白間相互作用。結(jié)論:1、成功構(gòu)建兩種不同的NAFLD小鼠模型。SIRT1-LKO小鼠呈現(xiàn)明顯的肝臟脂肪變,證實SIRT1可以抑制脂肪合成,與前期研究結(jié)果一致。2、小鼠肝臟組織中CRT蛋白在SIRT1-LKO及HFD組升高而m RNA水平不變,提示CRT蛋白水平變化可能是由于蛋白翻譯后修飾所致。3、成功構(gòu)建CRT過表達及RNA干擾慢病毒載體及相應(yīng)細胞系。細胞系中脂滴含量檢測提示CRT能夠抑制脂肪合成和FAS、Ch REBP等促進脂肪合成基因的表達。Co-IP提示SIRT1和CRT之間存在蛋白間相互作用。以上結(jié)果強烈提示CRT可能是SIRT1去乙�；孜锓肿�
【關(guān)鍵詞】：SIRT1 CRT 脂肪代謝
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R575.5
【目錄】：

• 縮略語表6-9
• 中文摘要9-12
• ABSTRACT12-16
• 前言16-18
• 文獻回顧18-28
• 第一部分 兩種NAFLD小鼠模型的建立和鑒定28-41
• 1 材料28-30
• 1.1 實驗動物28
• 1.2 主要試劑和藥物28-29
• 1.3 主要儀器及器材29-30
• 2 方法30-36
• 2.1 SIRT1-LKO小鼠的飼養(yǎng)和繁殖30
• 2.2 鼠尾組織基因組DNA的提取和鑒定30-32
• 2.3 實驗動物分組、處理及標本采集32
• 2.4 q RT-PCR檢測基因表達32-34
• 2.5 肝臟組織蛋白質(zhì)提取34
• 2.6 Western-Blot檢測蛋白表達34-35
• 2.7 HE染色35
• 2.8 免疫組化35-36
• 2.9 統(tǒng)計學處理36
• 3 結(jié)果36-39
• 3.1 HFD誘導小鼠肝臟脂肪變36-37
• 3.2 SIRT1-LKO小鼠ND時自發(fā)產(chǎn)生脂肪變37-39
• 4 討論39-41
• 第二部分 ITRAQ-MS/MS篩選獲得一組與SIRT1相關(guān)的差異蛋白41-50
• 1 材料41-42
• 1.1 實驗動物41
• 1.2 主要試劑及藥物41-42
• 1.3 主要儀器及器材42
• 2 方法42-45
• 2.1 實驗動物分組42-43
• 2.2 i TRAQ-MS/MS篩選差異蛋白43-44
• 2.3 c DNA array篩選差異基因44
• 2.4 RT-PCR檢測基因表達44-45
• 3 結(jié)果45-48
• 3.1 i TRAQ-MS/MS篩選獲得一組與SIRT1相關(guān)的差異蛋白45
• 3.2 i TRAQ-MS/MS提示CRT在HFD組和SIRT1-LKO組小鼠表達升高45-46
• 3.3 Western-Blot證實CRT在HFD組和SIRT1-LKO組小鼠中表達升高46-47
• 3.4 c DNA array顯示CRT基因水平在HFD組和SIRT1-LKO組無差異47-48
• 3.5 q RT-PCR顯示CRT m RNA水平在HFD組和SIRT1-LKO組無差異48
• 4 討論48-50
• 第三部分 SIRT1與CRT相互作用及功能驗證50-65
• 1 材料50-51
• 1.1 細胞株和菌株50
• 1.2 主要試劑及藥物50-51
• 2 方法51-57
• 2.1 CRT過表達慢病毒載體的構(gòu)建51-53
• 2.2 CRT RNAi慢病毒載體的構(gòu)建53-55
• 2.3 CRT過表達和RNAi穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系的建立及鑒定55
• 2.4 油紅O染色（細胞）55
• 2.5 BODIPY染色55-56
• 2.6 高內(nèi)涵檢測脂滴熒光強度56
• 2.7 免疫共沉淀56-57
• 3 結(jié)果57-63
• 3.1 構(gòu)建CRT過表達和RNA干擾L02細胞系57-59
• 3.2 構(gòu)建OA和PA誘導的細胞脂肪變模型59-60
• 3.3 高內(nèi)涵試驗檢測CRT對細胞脂肪合成的影響60-62
• 3.4 CRT抑制促進脂肪合成基因FAS, SCD的表達62
• 3.5 Co-IP顯示SIRT1和CRT之間存在蛋白間相互作用62-63
• 4 討論63-65
• 小結(jié)65-66
• 參考文獻66-79
• 個人簡歷和研究成果79-80
• 致謝80

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 殷錦錦;唐外姣;曾璐;周本杰;;人肝細胞系L-02細胞單純肝脂肪變性細胞模型的建立與應(yīng)用[J];南方醫(yī)科大學學報;2014年06期

  本文關(guān)鍵詞：SIRT1通過調(diào)控鈣網(wǎng)蛋白CRT參與脂質(zhì)代謝的機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：257977