【摘要】：目的:膽管病(Cholangiopathies)泛指以膽管上皮細(xì)胞(biliary epithelial cells,BECs)為主要攻擊靶點(diǎn)的一類疾病,其本質(zhì)是膽管上皮細(xì)胞受損后,上皮化的功能單位發(fā)生改建和纖維化。研究表明膽管纖維化常伴隨膽道的慢性感染。Toll樣受體4(Toll-like recepter,TLR4)作為炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)及細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵,其本身又是脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的天然受體。我們?cè)谇捌诘难芯恐邪l(fā)現(xiàn)TLR4可參與活化并激活由LPS介導(dǎo)的膽管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT現(xiàn)象,但其具體機(jī)制尚有待研究。TLR4是否是BECs發(fā)生EMT的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),以及下調(diào)TLR4能否抑制EMT,從而阻止膽道纖維化的發(fā)展?這一問題已成為研究的熱點(diǎn)。本研究旨在通過(guò)針對(duì)人膽管上皮細(xì)胞(human biliary epithelial cell lines,HIBEip C)TLR4的小干擾RNA病毒載體(LV-TLR4-RNAi),體外對(duì)HIBEpi C進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),降低TLR4 m RNA表達(dá),觀察LPS介導(dǎo)的EMT逆轉(zhuǎn)情況。探討LPS介導(dǎo)的EMT過(guò)程中,TLR4可能扮演的角色,以及核轉(zhuǎn)錄因子snail在EMT中可能發(fā)揮的調(diào)控作用。以期為以膽管纖維化為主要特點(diǎn)的膽道疾病的臨床藥物治療尋找新的靶點(diǎn),和提供新的思路。方法:將購(gòu)買的人膽管上皮細(xì)胞株(human biliary epithelial cell lines,HIBEpi C)進(jìn)行培養(yǎng)后,分別設(shè)立①control組(未感染任何病毒的正常細(xì)胞組);②control+LPS組(LPS誘導(dǎo)未感染病毒細(xì)胞組);③NC+LPS組(negative control+LPS,LPS誘導(dǎo)陰性對(duì)照病毒感染組)進(jìn)行實(shí)驗(yàn);④KD+LPS組(knock down+LPS,LPS誘導(dǎo)RNAi靶點(diǎn)病毒感染組)。②組將正常HIBEpi C與LPS共同培養(yǎng);④組將TLR4的小干擾RNA病毒載體LV-TLR4-RNAi轉(zhuǎn)染至正常HIBEpi C,收集感染率80%的細(xì)胞與LPS共同培養(yǎng);③組用陰性病毒CON077相同步驟進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染和LPS刺激。分別取0h、14h、24h、48h和72h等不同時(shí)相點(diǎn),通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后,膽管上皮細(xì)胞E-cadherin、TLR4和snail m RNA水平表達(dá)變化情況。①、②、③、④組分別進(jìn)行兩兩比較,結(jié)果用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果:1.LPS誘導(dǎo)正常HIBEpi C,14h、24h、48h、72h后細(xì)胞間排列變得松散,細(xì)胞呈現(xiàn)長(zhǎng)梭形改變,細(xì)胞突起增多。隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞形態(tài)越接近成纖維細(xì)胞樣形態(tài)。而刺激慢病毒轉(zhuǎn)染后的HIBEpi C,相同時(shí)相觀察細(xì)胞接近正常上皮樣細(xì)胞形態(tài),細(xì)胞大小基本一致,細(xì)胞形態(tài)各異,呈圓形、橢圓形、多邊形等。提示:TLR4-si RNA可抑制LPS誘導(dǎo)的HIBEpi C發(fā)生EMT。2.LPS刺激HIBEpi C后14h即可檢測(cè)到TLR4 m RNA表達(dá)量較正常HIBEpi C明顯升高(P0.01),隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),一直維持在較高水平。而④組經(jīng)LV-TLR4-RNAi病毒轉(zhuǎn)染的HIBEpi C,在LPS刺激下可檢測(cè)到TLR4 m RNA表達(dá)下降,0h、14h、24h、48h和72h敲減效率分別為73.5%、81.5%、89.9%、93.9%和82.6%;LPS刺激TLR4-si RNA后的HIBEpi C,0h即出現(xiàn)TLR4 m RNA表達(dá)量較③組明顯下降,至72h未見升高趨勢(shì)(P0.01)。結(jié)果說(shuō)明病毒轉(zhuǎn)染成功,TLR4-si RNA可特異性沉默TLR4m RNA表達(dá)。3.LPS刺激HIBEpi C,14h后可觀察到鋅指轉(zhuǎn)錄因子snail較正常細(xì)胞的表達(dá)量升高,繼續(xù)培養(yǎng)至24h、48h,其表達(dá)仍維持較高水平(P0.01)。同樣與③組比較,TLR4-si RNA的HIBEpi C,snail的表達(dá)隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),表達(dá)量降低,14h、24h、48h最明顯(P0.01)。說(shuō)明TLR4-si RNA可下調(diào)snail在HIBEpi C上的表達(dá)。4.LPS刺激可誘導(dǎo)HIBEpi C發(fā)生EMT現(xiàn)象,主要表現(xiàn)為上皮標(biāo)志物E-cadherin在轉(zhuǎn)錄水平受到明顯抑制,②組經(jīng)LPS刺激,14h起至72h內(nèi),可觀察到E-cadherin表達(dá)持續(xù)下降(P0.01)。而在TLR4-si RNA干擾后,與③組間比較,TLR4被阻斷14~48h均能檢測(cè)到E-cadherin的表達(dá)量出現(xiàn)上調(diào)(P0.01)。說(shuō)明TLR4-si RNA干擾后可抑制E-cadherin下調(diào)。5.LPS刺激陰性對(duì)照病毒轉(zhuǎn)染后的HIBEpi C,各時(shí)相點(diǎn)檢測(cè)到的EMT相關(guān)目的基因表達(dá)情況與②組表達(dá)情況基本相符,P0.05差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明病毒載體本身對(duì)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)影響。結(jié)論：1.通過(guò)RNA干擾技術(shù)沉默TLR4基因表達(dá),可有效抑制LPS誘導(dǎo)的膽管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT表型轉(zhuǎn)化;2.沉默TLR4的HIBEpi C中,上皮標(biāo)志物明顯升高,EMT現(xiàn)象受到了明顯的抑制;3.轉(zhuǎn)錄因子snail是EMT過(guò)程中重要的信號(hào)分子,在模擬的膽道感染的微環(huán)境中,其表達(dá)也受到TLR4的調(diào)控;4.TLR4可作為早期調(diào)控膽管上皮細(xì)胞EMT、抑制膽道纖維化進(jìn)程的藥物治療靶點(diǎn),對(duì)膽道結(jié)石、膽道感染所致的膽管纖維化防治有重要的潛在治療前景。
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【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R575.7

【參考文獻(xiàn)】

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1 趙禮金;楊日高;程龍;王麥建;江艷;余德剛;周廷梅;王曙光;;肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞上皮-間葉轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)研究[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2010年03期

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本文編號(hào)：2418948