本文關(guān)鍵詞：酒精性脂肪肝形成過(guò)程中肝細(xì)胞脂肪性病變的機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《山東大學(xué)》 2012年

酒精性脂肪肝形成過(guò)程中肝細(xì)胞脂肪性病變的機(jī)制

王冬梅  

【摘要】：研究背景： 在上世紀(jì)中葉,人們對(duì)酒精引起的脂肪肝就有所認(rèn)識(shí),長(zhǎng)期大量飲酒可導(dǎo)致酒精肝,這種效應(yīng)對(duì)長(zhǎng)期飲酒者可達(dá)99%以上。但對(duì)其機(jī)制的認(rèn)識(shí)與研究主要放在脂肪代謝與能量平衡的生化角度上去論述,對(duì)酒精引起脂肪肝的發(fā)病原因和途徑遠(yuǎn)沒(méi)有弄清楚。在脂肪肝形成過(guò)程中,大量的肝細(xì)胞可轉(zhuǎn)分化為脂細(xì)胞,這將嚴(yán)重影響肝臟的解毒功能,繼而會(huì)影響神經(jīng)、腎臟的功能,其后果非常嚴(yán)重,更嚴(yán)重的是脂肪肝會(huì)進(jìn)一步發(fā)展成酒精性肝炎、肝硬化,甚至肝癌。我們國(guó)家飲酒的人日益增多,長(zhǎng)期飲酒所引發(fā)的肝性疾病給個(gè)人、家庭及社會(huì)都造成了很大的負(fù)擔(dān)。我們只有弄清楚酒精肝的發(fā)病機(jī)制,才能真正找到預(yù)防的措施,為酒精性脂肪肝的治療提供實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。因此,此研究具有實(shí)際意義。 研究目的： 通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),分別原代培養(yǎng)非分離純化肝臟細(xì)胞和分離純化肝細(xì)胞,通過(guò)形態(tài)學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、分子學(xué)等檢測(cè)方法,觀察酒精處理實(shí)驗(yàn)組與正常對(duì)照組相比較肝細(xì)胞發(fā)生的各種變化,進(jìn)而探討酒精引起肝細(xì)胞脂肪性病變的機(jī)制,為研究酒精性肝病的治療藥物及臨床酒精性肝病的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究方法： 以體外原代培養(yǎng)5天齡KM乳小鼠肝細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料,進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)： 1.采用胰蛋白酶組織消化法體外原代、貼壁培養(yǎng)乳小鼠肝臟細(xì)胞； 2.原代培養(yǎng)乳小鼠肝臟細(xì)胞,細(xì)胞分離液分離純化,獲得單一、高純度的肝細(xì)胞； 3.實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)分為肝細(xì)胞未分離純化原代培養(yǎng)(第1組)與分離純化原代培養(yǎng)(第Ⅱ組)兩大組,每大組均設(shè)置正常對(duì)照組和酒精處理實(shí)驗(yàn)組(設(shè)50、100、200、300、400mmol／L5個(gè)酒精處理濃度)； 4.形態(tài)學(xué)觀察未分離純化原代培養(yǎng)中的細(xì)胞類型及分離純化后的肝細(xì)胞； 5.細(xì)胞化學(xué)PAS糖原染色法鑒定兩大組中的肝細(xì)胞； 6.免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定兩大組中的Kupffer細(xì)胞； 7.油紅0染色法檢測(cè)酒精處理兩大組細(xì)胞之后,肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性的程度,并用異丙醇萃取油紅0染液后,酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)在510nm處的吸光度值定量分析脂肪變性的程度； 8.酒精處理兩大組細(xì)胞之后,TR工zol裂解細(xì)胞提取總RNA.RT-PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳,ImageJ軟件對(duì)電泳圖譜進(jìn)行定量分析,檢測(cè)PPAR α與PPAR γ mRNA活性水平的變化； 9.酒精處理兩大組細(xì)胞之后,TRIzol裂解細(xì)胞提取總RNA.RT-PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳,ImageJ軟件對(duì)電泳圖譜進(jìn)行定量分析,檢測(cè)免疫因子TNF—α與IL-6mRNA活性水平的變化。 結(jié)果： 1.形態(tài)學(xué)觀察：倒置相差顯微鏡下,未分離純化原代培養(yǎng)的肝臟細(xì)胞有多種種類；分離純化后得到單一、純度較高的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞(肝細(xì)胞)。肝細(xì)胞呈球形、橢圓形或多邊形,邊界清晰,胞質(zhì)色淡,胞核位于正中,為單核或雙核；Kupffer細(xì)胞體積較大,呈球形或橢圓形；星形細(xì)胞呈不規(guī)則形,邊緣伸展出偽足。 2.PAS糖原鑒定：將原代培養(yǎng)的細(xì)胞種于飛片上,PAS染色后,倒置相差顯微鏡下可以觀察到肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)由于含有大量的糖原顆粒而顯示紅色。未分離純化原代培養(yǎng)的肝臟細(xì)胞只有一部分細(xì)胞顯示紅色,而分離純化后幾乎90%以上的細(xì)胞顯示紅色。 3. KuDffer細(xì)胞鑒定：采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色的方法,選用KuDffer細(xì)胞表面特異性抗原分子CD68做標(biāo)志性染色,熒光顯微鏡下觀察到Kupffer細(xì)胞表面由于特異性抗原分子CD68的存在而顯示紅色。未分離純化原代培養(yǎng)的肝臟細(xì)胞中有一小部分細(xì)胞顯示紅色,而分離純化后幾乎沒(méi)有細(xì)胞顯示紅色。 4.油紅0染色鑒定脂肪細(xì)胞：采用細(xì)胞化學(xué)染色的方法,對(duì)酒精處理后的兩大組細(xì)胞染色,油紅0為脂溶性染料,在脂肪內(nèi)能高度溶解,可特異性使組織內(nèi)的甘油三酯等中性脂肪著色,被染成紅色。未經(jīng)分離純化原代培養(yǎng)的肝臟細(xì)胞,酒精處理、油紅0染色后部分細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)顯示紅色,相比較,分離純化的肝細(xì)胞酒精處理、油紅0染色后幾乎很少有細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)顯示紅色。 5. PPAR α與PPAR γ mRNA活性水平的變化：用ImageJ圖像分析軟件分析PCR擴(kuò)增后的電泳圖譜,其mRNA相對(duì)表達(dá)量的分析結(jié)果顯示： 1)第1組,實(shí)驗(yàn)組不同酒精處理濃度PPAR α的mRNA活性水平分別與正常對(duì)照組相比較,結(jié)果表現(xiàn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),且隨著酒精處理濃度的升高,有降低的趨勢(shì)；實(shí)驗(yàn)組不同酒精處理濃度PPARγ的mRNA活性水平分別與正常對(duì)照組相比較,結(jié)果表現(xiàn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),且隨著酒精處理濃度的升高,有升高的趨勢(shì)； 2)第Ⅱ組,各比較結(jié)果表現(xiàn)為差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 6.免疫因子TNF-α與IL-6mRNA活性水平的變化：用ImageJ圖像分析軟件分析PCR擴(kuò)增后的電泳圖譜,其mRNA相對(duì)表達(dá)量的分析結(jié)果顯示： 1)第1組,實(shí)驗(yàn)組不同酒精處理濃度TNF-α與IL-6m的RNA活性水平分別與正常對(duì)照組相比較,結(jié)果表現(xiàn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),且隨著酒精處理濃度的升高,TNF-α與IL-6mRNA活性水平均有升高的趨勢(shì)： 2)第Ⅱ組,各比較結(jié)果表現(xiàn)為差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論： 1.本研究選用5d齡的KM乳小鼠作為實(shí)驗(yàn)材料,它是獲取肝臟細(xì)胞的理想材料; 2.本研究采用胰蛋白酶組織消化、貼壁培養(yǎng)法進(jìn)行體外原代培養(yǎng)肝臟細(xì)胞,并采用細(xì)胞分離液、適當(dāng)?shù)碾x心條件成功獲得純度較高的肝細(xì)胞； 3.本實(shí)驗(yàn)對(duì)脂肪細(xì)胞的鑒定選用油紅0染色的方法,并用異丙醇萃取油紅0染液測(cè)定波長(zhǎng)在510nm處的吸光度值,對(duì)脂肪變性進(jìn)行定量分析； 4.經(jīng)酒精處理后,與分離純化原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞相比較,未分離純化原代培養(yǎng)的肝臟細(xì)胞,發(fā)生了肝細(xì)胞向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象；PPAR α的mRNA活性水平較其正常對(duì)照組(沒(méi)有用酒精處理)有明顯的降低；而PPAR γ、TNF-α及IL-6的mRNA活性水平較其正常對(duì)照組有明顯的升高； 5.純化的肝細(xì)胞不易形成脂細(xì)胞；酒精處理肝臟細(xì)胞時(shí),可能是肝臟中的肝細(xì)胞在非實(shí)質(zhì)細(xì)胞及其產(chǎn)生的因子(包括免疫因子)的作用下發(fā)生了肝細(xì)胞脂肪變性即去分化或轉(zhuǎn)分化的現(xiàn)象。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R575.5
【目錄】：

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1 劉曙正;段廣才;Henrik S.Huitfeldt;;EGF通過(guò)TGFα-P53正反饋機(jī)制引起肝細(xì)胞增殖[A];全國(guó)腫瘤流行病學(xué)和腫瘤病因?qū)W學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2011年

2 曾濤;謝克勤;;大蒜油對(duì)酒精性脂肪肝的拮抗作用及相關(guān)機(jī)制[A];中國(guó)毒理學(xué)會(huì)第三屆中青年學(xué)者科技論壇暨2011年全國(guó)前列腺藥理毒理學(xué)研討會(huì)論文集[C];2011年

3 余昭銳;吳紅梅;;丹參聯(lián)合阿拓莫蘭治療酒精性脂肪肝效果觀察[A];貴州省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)2010年消化系病學(xué)術(shù)交流會(huì)暨非酒精性脂肪肝研究進(jìn)展學(xué)習(xí)班資料匯編[C];2010年

4 劉三都;;肝脂靈膠囊治療酒精性脂肪肝60例臨床研究[A];第十八次全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合肝病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2009年

5 劉洪峰;李俊;胡成穆;王焱;朱鵬里;;豹皮樟總黃酮對(duì)酒精性脂肪肝大鼠脂質(zhì)過(guò)氧化及TNF-α生成的影響[A];全國(guó)第十一屆生化與分子藥理學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2009年

6 包·納日斯;張藝;蘇榮高娃;;蒙藥益利肝丸治療脂肪肝的臨床研究[A];中醫(yī)理論臨床應(yīng)用學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2007年

7 余昭銳;陳燕;王苓瀟;吳紅梅;;丹參聯(lián)合阿拓莫蘭治療酒精性脂肪肝效果觀察[A];2009年貴州省中西醫(yī)結(jié)合消化系病學(xué)術(shù)交流暨專題學(xué)術(shù)講座論文匯編[C];2009年

8 劉三都;;肝脂靈膠囊治療酒精性脂肪肝60例臨床研究[A];貴州省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)2010年消化系病學(xué)術(shù)交流會(huì)暨非酒精性脂肪肝研究進(jìn)展學(xué)習(xí)班資料匯編[C];2010年

9 曾凡林;邱海燕;;酒精性脂肪肝42例超聲圖像分析[A];慶祝中國(guó)超聲醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)成立20周年——第八屆全國(guó)超聲醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2004年

10 林愛(ài)清;;美能治療酒精性脂肪肝臨床效果評(píng)價(jià)[A];科技、工程與經(jīng)濟(jì)社會(huì)協(xié)調(diào)發(fā)展——中國(guó)科協(xié)第五屆青年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2004年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 徐亞輝;Wistar大鼠酒依賴表觀遺傳機(jī)制及其對(duì)子代酒依賴易感性和表觀遺傳的影響[D];中南大學(xué);2012年

2 金玟成;解酒復(fù)方對(duì)酒精性脂肪肝大鼠肝纖維化的預(yù)防作用及機(jī)制[D];吉林大學(xué);2006年

3 史亞祥;扶脾活血化濁方藥治療酒精性脂肪肝的臨床與實(shí)驗(yàn)研究[D];南京中醫(yī)藥大學(xué);2009年

4 古賽;枸杞多糖防治大鼠酒精性脂肪肝的實(shí)驗(yàn)研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2007年

5 江義墩;新馬地區(qū)酒精性脂肪肝的證候特點(diǎn)及利濕化瘀解毒通降法干預(yù)的研究[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2008年

6 于繼紅;血管緊張素Ⅱ促進(jìn)酒精性肝纖維化的機(jī)制研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2008年

7 邢凌翔;實(shí)驗(yàn)性非酒精性脂肪性肝病發(fā)病機(jī)制的研究[D];華中科技大學(xué);2006年

8 胡成穆;貂皮樟總黃酮對(duì)酒精性脂肪肝大鼠防治作用及部分機(jī)制研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2011年

9 朱孔錫;線粒體DNA ATPase6，8基因突變與大鼠酒精性肝病發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性研究[D];山東大學(xué);2006年

10 劉曉華;谷胱甘肽對(duì)凡納濱對(duì)蝦抗氧化防御的調(diào)控機(jī)理[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 王冬梅;酒精性脂肪肝形成過(guò)程中肝細(xì)胞脂肪性病變的機(jī)制[D];山東大學(xué);2012年

2 王保偉;野菊花總黃酮對(duì)大鼠酒精性脂肪肝的防治作用及部分機(jī)制的研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2011年

3 遲秀頎;肝脂溶顆粒對(duì)酒精性脂肪肝大鼠血清脂質(zhì)和脂蛋白影響的實(shí)驗(yàn)研究[D];長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué);2011年

4 張衛(wèi)強(qiáng);美他多辛對(duì)酒精性脂肪肝大鼠肝組織中CYP2E1表達(dá)影響的研究[D];山東大學(xué);2010年

5 伊麗縈;術(shù)葛脂肝消顆粒治療酒精性脂肪肝的實(shí)驗(yàn)研究與理論探討[D];山東中醫(yī)藥大學(xué);2002年

6 賈珍容;三種核苷類抗病毒藥物對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞的毒性研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

7 張靜;小鼠酒精性脂肪肝中線粒體生物合成的損傷[D];鄭州大學(xué);2010年

8 胡金祥;內(nèi)源性一氧化氮與慢性酒精性肝脂肪變性關(guān)系的研究[D];浙江大學(xué);2002年

9 于學(xué)美;芪龍益肝方治療酒精性脂肪肝的理論和實(shí)驗(yàn)研究[D];山東中醫(yī)藥大學(xué);2005年

10 張金穎;芪茵顆粒治療酒精性脂肪肝肝郁脾虛型臨床研究[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2008年

  本文關(guān)鍵詞：酒精性脂肪肝形成過(guò)程中肝細(xì)胞脂肪性病變的機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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