本文選題：非酒精性脂肪性肝纖維化 + miRNAs　； 參考：《河北醫(yī)科大學》2014年博士論文

【摘要】：非酒精性脂肪性肝�。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除外酒精和其他明確因素所致的以肝實質細胞脂肪變性和脂肪貯積為主要特征的臨床病理綜合征，是與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關的獲得性代謝應激性肝損傷。NAFLD疾病譜包括單純性脂肪肝（simple fattyliver，SFL）、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）、肝纖維化及相關肝硬化。其中，NASH為該病進展的重要病理階段，以肝細胞脂肪變伴有壞死性炎癥和/或纖維化為主要特征，進一步可進展為肝硬化，甚至肝細胞癌。 近年來，隨著生活方式和飲食結構的改變，NAFLD的發(fā)病率逐年增高，并趨于年輕化。NAFLD患病率為歐美及澳大利亞等發(fā)達國家慢性肝病的首位，也是肝酶學異常的首要病因，普通人群患病率高達20%～40%。亞太地區(qū)NAFLD患病率為12%～24%，其中1/3～1/2為NASH，后者有15%～25%在10年內(nèi)可進展為肝硬化，而非酒精性脂肪性肝硬化患者原發(fā)性肝細胞癌、肝功能衰竭的發(fā)生率高達30%～40%。近年來我國NAFLD患病率逐年上升，城市人口患病率達15.35%～31.3%。據(jù)2010年城市人口健康調查結果，男性脂肪肝患病率為19%，女性為15%，分別為危害健康第一位和第九位的危險因素。南月敏等對健康體檢的綜合醫(yī)院醫(yī)務工作者連續(xù)隨訪5年，患病率達31.6%。朗振為等對不明原因肝炎病理學研究發(fā)現(xiàn)NASH占15.5%。NAFLD已成為危害人類健康和生活質量的主要肝臟疾病之一。非酒精性脂肪性肝炎/肝纖維化為NAFLD進展中的關鍵環(huán)節(jié)。但是，目前非酒精性脂肪性肝纖維化的發(fā)病機制尚不十分清楚，亦缺乏準確判斷病情的指標及特異有效的防治措施，對于非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)病機制、基因診斷標志及治療新靶點的探索十分必要和迫切。 MicroRNAs（miRNAs）作為一種重要的轉錄后調節(jié)因子在肝臟的生成、分化及代謝過程中發(fā)揮著重要的調控作用。Sanyal等發(fā)現(xiàn)在NASH患者肝組織中miR-34a和miR-146b表達上調、miR-122下調。其中，miR-122可通過負性調控固醇調節(jié)元件結合蛋白-1c（Sterol ResponsiveElement Binding Protein-1c， SREBP-1c）、脂肪酸合成酶（fatty acidsynthetase，F(xiàn)AS）和HMG-CoA還原酶（HMG CoA reductase，HMGCR）的表達，參與肝細胞脂肪酸的生物合成過程。而miR-33a與miR-33b也可通過調控固醇調節(jié)元件結合蛋白（Sterol Responsive Element BindingProtein，SREBP）轉錄因子的表達，參與膽固醇和脂肪代謝的調控。miR-34a通過抑制�；o酶A合成酶長鏈家族成員1（acyl-CoA synthetaselong-chain family member1，ACSL1）的表達、去乙�；�-1的表達調控腺苷一磷酸激酶（AMP kinase）和HMG-CoA還原酶的脫磷酸化，參與膽固醇的生物合成過程。另外，miR-467b通過負性調控其靶蛋白肝臟脂蛋白酶表達，減少游離脂肪酸的生成，參與胰島素抵抗（insulin resistance，IR）導致脂質沉積過程的調控。miR-103與miR-107可通過調控其靶基因胰島素受體小窩蛋白-1（Caveolin-1，，CAV1），調節(jié)胰島素敏感性、維持血糖平衡。作為轉錄后調節(jié)因子，特定的miRNAs可能參與NAFLD的發(fā)生發(fā)展，但其具體調控機制有待進一步研究。 本研究首先應用膽堿-蛋氨酸缺乏（methionine and choline deficience，MCD）飲食8周建立非酒精性脂肪性肝纖維化動物模型，應用基因芯片技術檢測小鼠肝組織中miRNAs表達譜的變化；采用實時定量PCR方法驗證各組小鼠肝組織中差異表達的miRNAs，篩選與非酒精性脂肪性肝纖維化有關表達變化最明顯的miRNA；通過生物信息學軟件預測miRNA的靶基因，進行功能分類和信號通路預測；采用實時定量PCR及westernblot方法檢測miRNA靶基因及靶蛋白在非酒精性肝纖維化小鼠肝組織中的表達變化。構建含有目標miRNA靶基因3′-UTR的報告載體，采用熒光素酶實驗（Luciferase Reporter Assay）進一步驗證miRNA對其靶基因的調控作用。靶向調控LX-2細胞中關鍵miRNA表達，觀察非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)病關鍵基因表達變化，深入闡明miRNAs在非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)病過程中的作用、其作用的靶基因及主導分子信號通路，為非酒精性脂肪性肝纖維化的臨床防治提供新的靶點及依據(jù)。 第一部分：非酒精性脂肪性肝纖維化小鼠肝組織中異常表達miRNAs的篩選與驗證 目的：篩選非酒精性脂肪性肝纖維化形成過程中異常表達的miRNAs。 方法：采用MCD飲食喂養(yǎng)6~7周齡清潔級健康雄性C57BL/6J小鼠8周，建立非酒精性脂肪性肝纖維化模型，以膽堿蛋氨酸充足飼料喂養(yǎng)對照組小鼠。酶聯(lián)免疫法測定小鼠血清中丙氨酸氨基轉移酶（alanineaminotransferase， ALT）及天門冬氨酸氨基轉移酶（aspartateaminotransferase，AST）的水平；HE及Masson染色觀察肝臟組織脂肪變性、炎癥活動及纖維化程度，并進行組織學評分；應用Qiagen公司的MiRNeasy Mini Kit試劑盒提取部分新鮮肝臟組織的總RNA，分光光度計測定RNA質量，1%瓊脂糖凝膠電泳測定RNA純度，采用AffymetrixmiRNA基因表達譜芯片GeneChip miRNA2.0Array進行雜交，進行miRNAs基因芯片檢測，篩查在非酒精性脂肪性肝纖維化小鼠肝組織中異常表達的miRNAs并進行實時定量PCR驗證。 結果： 1.一般情況：造模過程中，對照組小鼠活潑，毛發(fā)有光澤，體重逐漸增加；MCD模型組小鼠精神萎靡，少動，毛發(fā)紊亂、無光澤，攝食明顯減少，體重增長緩慢，隨著時間推移，模型組小鼠出現(xiàn)被毛脫落現(xiàn)象。 2.肝指數(shù)變化：MCD模型組小鼠體重顯著低于對照組（P 0.05），肝濕重較對照組無明顯變化（P0.05），肝指數(shù)（肝濕重/體重×100%）較對照組明顯升高（P 0.05）。 3.各組小鼠血生化指標的結果：MCD組血清中ALT及AST的水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P 0.05）。 4.各組小鼠肝組織HE及Masson染色的結果：MCD組小鼠肝細胞出現(xiàn)重度脂肪變性，并伴點狀和灶狀壞死、炎性細胞浸潤、匯管區(qū)纖維組織增生及竇周纖維化等。 5. miRNAs芯片結果：與對照組相比，MCD模型組有47個差異表達的miRNAs（P 0.05），其中15個變化在2倍之上。mmu-let-7i、mmu-mir-155、 mmu-mir-199a-5p、 hsa-mir-34a、 mmu-mir-221、mmu-mir-200c、 mmu-mir-297c、 mmu-mir-713、 mmu-mir-190b、mmu-mir-678，10個miRNAs在MCD模型組的肝臟組織中表達明顯上調；mmu-mir-122、mmu-mir-103、mmu-mir-146、mmu-mir-101a、mmu-mir-466j，5個miRNAs在MCD模型組的肝臟組織中表達明顯下調。 6.綜合本實驗基因芯片結果及相關文獻報道，選擇miR-122、miR-221及miR-199a-5p進行實時熒光定量RT-PCR驗證，結果顯示，與正常對照組相比，MCD組小鼠肝組織中miR-199a-5p的表達明顯增高、miR-122明顯降低（P 0.05）。 結論： 1在MCD飲食誘導的小鼠非酒精性脂肪性肝纖維化動物模型中，肝組織miRNAs表達譜明顯改變，表明差異表達的miRNAs參與非酒精性脂肪性肝炎／肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。 2miR-199a-5p可能為非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)生發(fā)展的重要調控基因之一。第二部分：miR-199a-5p生物信息學分析及靶基因驗證 目的：探討miR-199a-5p在非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)病中可能的作用及其潛在的作用靶點。 方法：動物分組及標本取得同第一部分。應用TargetScan6.2、miRanda及PITA軟件共同預測miR-199a-5p的靶基因，應用DAVID軟件分析miR-199a-5p可能的生物學功能及參與調節(jié)的信號通路。采用實時熒光定量RT-PCR及Western blot法分析在非酒精性脂肪性肝纖維化小鼠肝組織中miR-199a-5p靶基因mRNA及蛋白水平的表達變化情況。 結果： 1.生物信息學分析結果：GO分析結果顯示，miR-199a-5p參與了轉錄調控、轉錄因子復合物組成、絲蘇氨酸蛋白激酶活化等多種生物學調控；KEGG分析顯示，miR-199a-5p參與胰島素信號通路、Wnt信號通路、MAPK信號通路等多條通路的調控。 2. miR-199a-5p的靶基因預測：應用三種miroRNA靶基因預測軟件（TargetScan、PITA和miRanda）共同預測miR-199a-5p的靶基因，得到26個與miR-199a-5p相關的基因。 3.各組小鼠肝臟組織中miR-199a-5p靶基因核受體共抑制劑1（nuclear receptor corepressor，NCOR1)的表達情況：與對照組相比，MCD組肝組織中NCOR1蛋白的表達明顯減少（p 0.05），與miR-199a-5p的表達負相關；模型組與對照組肝組織NCOR1mRNA表達無明顯差異。 結論： 1生物信息學分析結果示，miR-199a-5p參與胰島素信號通路、Wnt信號通路、MAPK信號通路等多條與非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)生發(fā)展相關信號通路的調控。 2在MCD飲食誘導的肝纖維化模型中，miR-199a-5p可能通過調控NCOR1蛋白的表達參與疾病的發(fā)生與進展。 第三部分：miR-199a-5p與其靶基因NCOR1的相互作用機制 目的：驗證miR-199a-5p與NCOR13′-UTR靶向調節(jié)關系。 方法：根據(jù)Gene Bank公布的人NCOR1基因3′-UTR序列設計含有miR-199a-5p結合位點的NCOR13′-UTR PCR引物，并在引物中加入Not I和Xho I兩個限制性酶切位點。將擴增的NCOR13′-UTR序列插入攜帶螢火蟲熒光與海腎熒光雙熒光報告基因的psiCHECKTM-2質粒的Xho I和Not I位點之間，構建NCOR13′-UTR-luciferase報告載體，將NCOR13′-UTR-luciferase報告載體與pre-miR-199a-5p共同轉染至HEK293細胞，48h后檢測熒光強度，并計算螢火蟲熒光與海腎熒光的比值。分析miR-199a-5p對NCOR1的靶向調控作用。 結果： 1.查詢“Ensembl Mouse database”，得到全長2202bp的NCOR13′-UTR序列，其中，在NCOR13′-UTR的790bp～796bp處存在可能與miR-199a-5p結合的位點。 2.從血液中提取基因組DNA經(jīng)PCR擴增后，擴增產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠上進行電泳顯示出一條約2000bp特異性片段，實驗與預期結果相符。重組質粒p3′UTR-NCOR1經(jīng)上海生工進一步測序鑒定質粒構建正確。 3.將構建的p3′UTR-NCOR1質粒與pre-miR-199a-5p或陰性對照序列共轉染至HEK293細胞，48h后檢測熒光素酶活性。結果顯示，與對照組相比，miR-199a-5p可以直接作用于NCOR13′-UTR序列，并可抑制熒光素酶活性。。 結論：miR-199a-5p可靶向作用于NCOR13′-UTR，負性調控NCOR1的表達。第四部分：miR-199a-5p靶向調控對LX-2細胞活力與功能的影響 目的：靶向調控LX-2細胞中miR-199a-5p表達，觀察非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)病關鍵基因表達變化，深入闡明miRNAs在非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)病過程中的作用、其作用的靶基因及主導分子信號通路，為非酒精性脂肪性肝纖維化的臨床防治提供新的靶點及科學依據(jù)。 方法：應用人肝星狀細胞系LX-2細胞，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2孵箱中進行培養(yǎng)。當細胞融合度達到60%左右時，用不同濃度miR-199a-5p的模擬物及抑制劑轉染LX-2細胞，采用MTT法測定各組細胞活力，選擇合適的轉染濃度。采用實時熒光定量PCR及Western-blot法分析miR-199a-5p及其靶基因NCOR1mRNA及蛋白的表達情況。同時應用Western-blot方法觀察miR-199a-5p對非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)病關鍵因子的影響。 結果： 1. MTT結果顯示，轉染不同濃度的對照序列對LX-2細胞活力無明顯影響；轉染100nM及150nM的miR-199a-5p模擬物后，LX-2細胞活力明顯降低，而轉染50nM的模擬物，則無明顯變化；轉染100nM及150nM的miR-199a-5p抑制劑后，LX-2細胞活力明顯增強，而50nM的miRNA抑制劑則對細胞活力無明顯影響； 2.各轉染組與未轉染組LX-2細胞相比，miR-199a-5p的表達量有不同程度改變，miR-199a-5p靶基因NCOR1mRNA的表達量則無明顯變化。與未轉染組比較，NC組miR-199a-5p的表達量無明顯變化，Mimic組miR-199a-5p的表達量顯著增高（P 0.01），Inhibitor組miR-199a-5p表達量明顯降低（P 0.05）； 3.轉染后細胞miR-199a-5p靶蛋白NCOR1及過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ）蛋白的表達量有不同程度改變，與未轉染組比較，NC組NCOR1和PPARγ蛋白的表達量均無明顯變化，Mimic組NCOR1蛋白的表達量顯著降低，PPARγ蛋白的表達量明顯增高（P 0.05），Inhibitor組NCOR1蛋白表達量明顯增高，PPARγ蛋白的表達量則降低（P 0.05）。PPARγ蛋白與轉染各組細胞中NCOR1蛋白的表達變化相反； 4.轉染后細胞肝纖維化相關蛋白轉化生長因子β1（transforminggrowth factor beta，TGFβ1）、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的表達量有不同程度改變，與未轉染組比較，NC組TGF-β1及α-SMA蛋白的表達量無明顯變化，Mimic組TGF-β1及α-SMA蛋白的表達量顯著降低（P 0.05），Inhibitor組TGF-β1及α-SMA蛋白表達量明顯增高（P 0.05）。TGF-β1及α-SMA蛋白與轉染各組細胞中NCOR1蛋白的表達變化一致。 結論： 1轉染miR-199a-5p模擬物或抑制劑可引起LX-2細胞活力的改變，提示miR-199a-5p可能通過影響HSC細胞增殖及活化參與非酒精性脂肪性肝纖維化的發(fā)病過程。 2miR-199a-5p可能通過負性調控NCOR1蛋白表達影響PPARγ蛋白活性，參與肝星狀細胞的激活。 3靶向調控miR-199a-5p表達可阻止或逆轉肝纖維化的發(fā)生與進展。
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【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R575.2

【參考文獻】

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本文編號：1881160