發(fā)布時間：2018-03-09 08:50

  本文選題：子宮內(nèi)膜再生細胞　切入點：B淋巴細胞　出處：《天津醫(yī)科大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景潰瘍性結(jié)腸炎為發(fā)生于腸道的慢性非特異性炎癥,病程遷延不愈,發(fā)病機制復雜,B細胞功能的失衡被認為在潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病中具有重要作用。目前潰瘍性結(jié)腸炎仍缺乏有效治療手段,近年來干細胞治療在潰瘍性結(jié)腸炎中得到應用。取自月經(jīng)血的子宮內(nèi)膜再生細胞(Endometrial Regenerative Cells,ERC)作為干細胞新來源,不但具有自我更新潛能、間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal Stem Cells,MSC)樣表型特征、免疫調(diào)節(jié)作用,還具有取材無創(chuàng)、來源相對無限、增殖能力強、避免倫理問題的獨特優(yōu)勢。ERC是否可以影響B(tài)細胞功能,并通過誘導調(diào)節(jié)性B細胞(Regulatory B cells,Breg)在結(jié)腸炎中發(fā)揮保護作用仍有待闡明。目的1.從育齡志愿者婦女月經(jīng)血中獲取ERC,建立從分離、培養(yǎng)、傳代、凍存和復蘇的方法體系;2.體外明確ERC對B細胞的作用;3.利用葡聚糖硫酸鈉建立小鼠結(jié)腸炎模型,探討ERC對結(jié)腸炎小鼠體內(nèi)B細胞的免疫調(diào)節(jié)作用;4.探究輸注的ERC在體內(nèi)的分布,明確其如何發(fā)揮對B細胞的免疫調(diào)節(jié)作用;5.通過過繼治療的方法探討ERC是否通過Breg發(fā)揮保護作用。方法第一部分:從健康育齡志愿者婦女月經(jīng)血中分離ERC在健康育齡婦女月經(jīng)期第2-3日,通過月事杯采集月經(jīng)血。以密度梯度離心法分離單個核細胞層,并進行體外培養(yǎng)傳代擴增。應用流式細胞術(shù),對ERC的免疫表型進行鑒定。第二部分:ERC體外調(diào)節(jié)B細胞功能磁珠分選小鼠脾臟CD19+B淋巴細胞,在ERC存在或缺失的條件下,以LPS作為刺激劑構(gòu)建培養(yǎng)體系。通過3H-胸腺嘧啶核苷酸摻入法檢測B細胞的增殖。通過臺盼藍拒染法檢測B細胞活性,并經(jīng)Annexin V、7-AAD染色后通過流式檢測B細胞凋亡。流式檢測B細胞表面與其活化相關(guān)的分子表達。收集培養(yǎng)體系上清液,ELISA法檢測上清液中IgM和IgG的含量。收集懸浮的B細胞并經(jīng)固定破膜,流式檢測IL-10+的調(diào)節(jié)性B細胞比例,ELISA法檢測上清液中IL-10的含量。第三部分:ERC調(diào)節(jié)B細胞功能在結(jié)腸炎中的治療作用造模方法:3%葡聚糖硫酸鈉自由飲用的方法誘導Balb/c小鼠結(jié)腸炎模型。實驗分組:將6-8周齡,體重18-22g的雄性Balb/c小鼠隨機分為3組,每組6-8只:(1)正常對照組:小鼠自由飲用蒸餾水;(2)DSS模型未治療組:自由飲用含3%DSS的蒸餾水7天,隨后更換蒸餾水,造模第2、5、8日經(jīng)尾靜脈輸注200μl PBS;(3)ERC治療組:自由飲用含3%DSS的蒸餾水7天,隨后更換蒸餾水,造模第2、5、8日經(jīng)尾靜脈輸注200μl含有1×106 ERCs的PBS。每日記錄小鼠生存情況,測量體重,并觀察其一般情況、大便性狀與便血情況,計算DAI評分,以評估疾病活動性。造模第10日取材,測量結(jié)腸長度,HE染色觀察結(jié)腸病理損傷。ELISA法檢測結(jié)腸勻漿液中炎性因子水平。Western blot法和PCR法檢測脾臟IL-10的蛋白水平及mRNA轉(zhuǎn)錄水平。流式細胞術(shù)分析脾臟、腸系膜淋巴結(jié)、腹腔灌洗液中免疫細胞比例。PKH26熒光標記ERCs,活體成像檢測輸入體內(nèi)后的分布情況。分離具有免疫抑制功能的Breg,通過過繼治療探究ERC是否通過該種細胞發(fā)揮保護作用。結(jié)果第一部分:從健康育齡婦女月經(jīng)血中分離ERC通過密度梯度離心法成功從健康育齡婦女月經(jīng)血中獲取ERC。3天后初次換液可見貼壁的原代細胞。隨生長逐漸拉伸具有梭形外觀,匯合后呈編織狀或漩渦狀結(jié)構(gòu)。傳代后細胞生長增殖速度加快,倍增時間約為24小時。約3代后,其生物學特性及形態(tài)學特征趨于一致。流式檢測表明ERC具有類似于MSC的分子表型,表達CD90和CD105,而不表達造血干細胞特異性抗原CD34和CD45。且經(jīng)傳代、凍存及復蘇之后仍穩(wěn)定具備此表型。第二部分:ERC體外調(diào)節(jié)B細胞功能ERC可在不影響B(tài)細胞活性的情況下,體外抑制LPS誘導的B淋巴細胞多克隆增殖,且不增加B細胞凋亡。同時ERC可抑制B細胞活化及分泌抗體,并具有劑量依賴的特點。隨ERC與B細胞數(shù)量比增加,其抑制效應也進一步增強。另一方面,ERC可誘導具有免疫抑制功能的Breg產(chǎn)生及IL-10的分泌。第三部分:ERC通過調(diào)節(jié)B細胞的功能在結(jié)腸炎中發(fā)揮治療作用ERC可提高結(jié)腸炎小鼠生存率,降低體重下降幅度,一般狀況惡化及大便性狀改變或發(fā)生便血的時間晚于DSS模型組,且程度較輕,更換飲用水后迅速恢復。大體標本顯示,ERC治療組小鼠結(jié)腸長度縮短較少,且大體病理改變(包括腸管僵直、腸壁充血、近端結(jié)腸擴張及遠端結(jié)腸狹窄情況)較輕。HE染色表明,ERC可減輕DSS造成的小鼠結(jié)腸炎癥病理改變。黏膜結(jié)構(gòu)較完整,黏膜及黏膜下層炎性細胞浸潤情況顯著低于DSS模型組,充血及水腫情況明顯減輕。同時ERC可顯著降低結(jié)腸炎小鼠炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平,提高具有抗炎作用的IL-10水平。ERC限制結(jié)腸炎小鼠脾臟T淋巴細胞過度增殖,降低CD3+T淋巴細胞的比例,以減少CD4+T淋巴細胞比例更為顯著,并提高調(diào)節(jié)性T細胞比例。同時,ERC抑制脾臟B淋巴細胞分化為漿細胞,減輕結(jié)腸炎小鼠腸道組織中IgG抗體的沉積,降低腸道勻漿上清液中IgG的含量。ERC可提高結(jié)腸炎小鼠脾臟中IL-10+CD19+Breg比例,提高CD1dhiB細胞在脾臟、腹腔以及腸系膜淋巴結(jié)中的比例。同時ERC治療后小鼠脾臟CD1dhiCD5+B淋巴細胞顯著增多,且為IL-10的重要來源。從ERC治療后的結(jié)腸炎小鼠脾臟中分離獲得CD1dhiCD5+B淋巴細胞,經(jīng)過繼治療后,可有效緩解結(jié)腸炎癥狀,促進腸道恢復。ERC在小鼠結(jié)腸、腸系膜淋巴結(jié)、肝臟、腎臟、脾臟及肺臟均有所富集。其中遠端結(jié)腸和腸系膜淋巴結(jié)富集最為顯著。說明ERC注射入體后,主要分布在炎癥反應部位以及炎癥引流的淋巴組織。結(jié)論1.建立ERC分離培養(yǎng)體系,ERC具有梭形形態(tài)及MSC樣表型特征,可在體外大量擴增。2.ERC可體外抑制B細胞的增殖、活化、抗體分泌,誘導Breg產(chǎn)生。3.成功利用DSS所誘導的結(jié)腸炎模型,闡明ERC可減輕結(jié)腸炎癥狀、促進恢復,并減輕腸道病理損傷和炎癥反應。4.輸入體內(nèi)的ERC可募集于炎癥損傷部位及炎癥引流的淋巴組織。5.ERC可調(diào)控免疫細胞平衡,抑制DSS結(jié)腸炎模型中B細胞分化為漿細胞及抗體的沉積,另一方面誘導具有免疫調(diào)節(jié)作用的Breg產(chǎn)生。6.過繼治療結(jié)果表明,ERC可能通過誘導Breg發(fā)揮其在結(jié)腸炎中的治療作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R574.62

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