本文關鍵詞： 戊型肝炎病毒 開放讀碼框3 核因子-κB 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激　出處：《華中科技大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景 由于人們在20世紀80年代之前尚沒有認識到戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)的存在,故HEV被眾多學者稱為“被遺忘的病毒”。直到上世紀80年代,在蘇聯(lián)占領的阿富汗軍營中爆發(fā)了一種不明原因的肝炎,后來研究人員利用電鏡在志愿者的大便中發(fā)現(xiàn)了病毒顆粒,經(jīng)基因測序,于1991年正式命名為HEV。近年來,隨著醫(yī)學檢測手段的不斷提高以及人們對其認識的不斷深入,HEV所引起的公共衛(wèi)生問題也逐漸成為科學界關注的焦點。先前認為,HEV感染主要發(fā)生于基礎衛(wèi)生設施條件較差的發(fā)展中國家,但近年來,在歐美、日本等一些發(fā)達國家也出現(xiàn)了一些非輸入性本土化的HEV感染病例。目前,HEV感染呈全球分布,全世界每年約20億人感染HEV,約1400萬人為有癥狀者,每年約30萬人死于HEV感染,HEV感染占急性肝炎的50%以上,已成為全球急性病毒性肝炎的首要病因。自2012年開始至今,HEV在我國的感染及死亡總?cè)藬?shù)每年均超過甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)。傳統(tǒng)觀念認為,HEV感染后為一自限性過程,但在普通人群中仍有1-2%的患者發(fā)展為重型肝炎而導致死亡,孕婦感染HEV后可導致高達26.9%的死亡率,近年來在器官移植、腫瘤放化療及HIV感染者等一些免疫功能受到抑制的人群中出現(xiàn)了為數(shù)不少的慢性化病例的報道。因此,戊肝的防控形勢不容樂觀。盡管我國在2012年上市了全球第一支HEV疫苗,但HEV致病的確切機制并未得以詳細的闡明。 HEV是一單股正鏈RNA病毒,全長約7.2kb,有3個開放讀碼框(ORF),4個基因型,1個血清型。其中,基因Ⅰ型和Ⅱ型主要感染人類,而Ⅲ型和Ⅳ型為人畜共患性疾��；我國主要流行基因Ⅰ型和Ⅳ型。研究發(fā)現(xiàn),基因Ⅰ型HEV感染后相較其它基因型HEV感染具有更高的病毒血癥和更嚴重的病情,但機制不明。由于缺乏成熟的小動物研究模型和體外細胞模型,目前對HEV致病機制的研究大多集中于對其基因組功能的分析上。HEV的ORF1和ORF2分別編碼HEV的非結(jié)構(gòu)蛋白和衣殼蛋白,ORF3片段具體的功能目前尚沒有一致意見。 本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),HEV ORF3蛋白抑制TNF-a誘導的p65入核,我們推測,ORF3蛋白可能通過調(diào)控宿主細胞核因子-κB (nuclear factor-kappa B, NF-κB)信號為HEV復制優(yōu)化環(huán)境。本研究通過構(gòu)建HEV ORF3蛋白的真核表達質(zhì)粒,以人肺腺癌A549上皮細胞(A549)為載體,檢測HEV ORF3對細胞NF-κB信號的影響,從細胞水平進一步探討HEV ORF3蛋白在TNF-α誘導的NF-κB信號調(diào)節(jié)中的具體作用及機制,初步揭示HEV感染后細胞內(nèi)信號異常與HEV致病的相關性,為闡明HEV的致病機制奠定理論基礎。 研究目的 在前期研究工作基礎上,進一步探討基因Ⅰ型戊型肝炎病毒ORF3蛋白在TNF-α誘導的NF-κB信號轉(zhuǎn)導中的作用及調(diào)控機制,闡明基因Ⅰ型HEV導致較高病毒血癥及較嚴重病程的具體機制。 實驗方法 1.根據(jù)已經(jīng)報道的巴基斯坦株Sar-55(基因Ⅰ型HEV)的cDNA序列中ORF3片段的序列,分別設計其上下游引物,采用PCR方法擴增出HEV ORF3片段,利用限制性內(nèi)切酶將ORF3片段連接在真核表達載體pEGFP-N1上,構(gòu)建帶有綠色熒光的ORF3真核表達質(zhì)粒(ORF3-GFP),基因測序及酶切鑒定正確； 2.將鑒定正確的ORF3-GFP融合蛋白瞬時轉(zhuǎn)染A549細胞,48小時后,以TNF-a (50ng/ml)誘導NF-κB信號活化,通過蛋白印跡技術(shù)(Western blot)分別檢測細胞漿和細胞核內(nèi)p65的表達水平,通過凝膠電泳遷移實驗(EMSA)檢測NF-κB的DNA結(jié)合活性,分別以實時熒光定量PCR (real time PCR)和酶聯(lián)免疫技術(shù)(ELISA)檢測NF-κB下游分子的變化情況； 3.用Western blot檢測NF-κB經(jīng)典信號通路途徑中IKKβ的活性變化及IKBa的磷酸化水平的變化；以基因芯片技術(shù)(PCR Array)初步篩選ORF3-GFP作用于NF-κB信號通路中的關鍵分子,并以real time PCR和Western blot技術(shù)分別從mRNA水平和蛋白水平進行驗證； 4.設計并合成上述PCR Array中發(fā)現(xiàn)的負性調(diào)控基因的三條特異的小干擾RNA (small interfering RNA, siRNA),進行干擾效果的初步評估,采用RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術(shù)干擾上述初篩的主要調(diào)控基因后,以熒光素酶報告基因活性檢測TNF-a誘導的NF-κB活性的變化； 5.通過Western blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和非折疊蛋白反應的標志蛋白,觀察A20分子表達與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的相關性；給予非折疊蛋白反應的阻滯劑對細胞進行預處理,然后轉(zhuǎn)染ORF3-GFP,給予TNF-α干預,以熒光素酶報告基因活性檢測NF-κB活性。 實驗結(jié)果 1.成功構(gòu)建了基因Ⅰ型HEV ORF3表達載體,將其轉(zhuǎn)染A549細胞,48小時后,熒光顯微鏡下可以看到綠色熒光表達,以HEV ORF3單克隆抗體行Western blot檢測,驗證了ORF3蛋白在A549細胞中成功表達,將構(gòu)建的質(zhì)粒經(jīng)基因測序及酶切鑒定正確； 2.Western blot顯示,在沒有TNF-α刺激時,p65主要位于細胞漿內(nèi),給予TNF-α刺激后,空白組及轉(zhuǎn)染空載體的A549細胞,p65出現(xiàn)了明顯的核轉(zhuǎn)移,而轉(zhuǎn)染了ORF3-GFP蛋白的細胞,給予TNF-α刺激后,細胞核內(nèi)p65的數(shù)量極少; 3.EMSA實驗表明,轉(zhuǎn)染GFP的細胞和未處理的細胞給予TNF-α刺激后,與陽性對照組一樣,出現(xiàn)了蛋白-DNA復合物,而表達ORF3-GFP蛋白的細胞組即使給予TNF-α刺激,也未見蛋白-DNA復合物的出現(xiàn),蛋白-DNA復合物在冷競爭實驗時消失,而進行突變競爭實驗時,該復合物再次出現(xiàn); 4.Real time PCR示ORF3-GFP明顯抑制了TNF-α誘導的NF-κB的下游基因IL-1β、COX2和ICAM1的mRNA表達水平;ELISA證實NF-κB的下游分子IL-1β、 COX2、和ICAM1的蛋白水平也同樣受到了抑制； 5.Western blot顯示,空白細胞組和轉(zhuǎn)染空載體的細胞組給予TNF-a刺激后,IKKβ活性和IKBa的磷酸化水平明顯增強,而轉(zhuǎn)染ORF3-GFP蛋白的細胞給予TNF-a刺激后, IKKβ活性和IKBa的磷酸化水平明顯受到抑制； 6.PCR Array實驗表明,轉(zhuǎn)染ORF3-GFP蛋白的細胞A20基因水平明顯高于對照組10倍以上,real time PCR和western blot也證實了同樣的結(jié)果; 7.將A20基因進行RNAi后,ORF3-GFP蛋白抑制NF-κB活性的現(xiàn)象得到了逆轉(zhuǎn)；表達ORF3-GFP蛋白的細胞組A20的升高與GRP78呈正相關性,將非折疊蛋白反應(unfolded protein response, UPR)抑制后,ORF3-GFP抑制TNF-α誘導的NF-κB活性的現(xiàn)象也得到了逆轉(zhuǎn)。 結(jié)論 1.基因Ⅰ型HEV ORF3蛋白抑制TNF-β誘導的NF-κB活性及其下游分子,提示這可能是基因Ⅰ型HEV在體內(nèi)持續(xù)存在并引起較高病毒血癥和更長病程的原因： 2.基因Ⅰ型HEV ORF3蛋白在早期可能通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和UPR激活NF-κB信號,隨后,NF-κB下游的靶基因A20在NF-κB信號中發(fā)揮負性調(diào)控作用,及時終止NF-κB信號的無限放大。這提示,ORF3蛋白在不同的階段對NF-κB信號的調(diào)控可能存在雙向調(diào)節(jié)作用。 3.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與NF-κB信號之間有著密切聯(lián)系,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激不僅可以激活NF-κB信號,在特定環(huán)境下,還可以對NF-κB信號發(fā)揮負性調(diào)控作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R512.6

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本文編號：1531601