本文關(guān)鍵詞：靶向調(diào)控β-arrestin2的表達(dá)對肝纖維化星狀細(xì)胞膠原產(chǎn)生的影響

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【摘要】：肝纖維化(hepatic fibrosis, HF)是肝組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)過度增生與異常沉積,導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)、功能異常的病理變化。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell, HSC)是肝纖維化ECM的主要來源。轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)是引起HSC活化并產(chǎn)生膠原的主要細(xì)胞因子。β-arrestin2屬于arrestin家族,是眾所周知的G蛋白偶聯(lián)受體的調(diào)節(jié)蛋白,同時作為支架蛋白和連接蛋白,參與受體在胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。近年來研究顯示,β-arrestin2的異常表達(dá)與纖維化疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。本研究探討β-arrestin2對HSC膠原產(chǎn)生的影響,及其機(jī)制是否與調(diào)節(jié)TGF-βⅢ型受體(the type Ⅲ TGF-β receptor, TβRⅢ)相關(guān),為肝纖維化的防治提供新的靶點(diǎn)。本實(shí)驗首先建立了豬血清(porcine serum, PS)誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠模型,檢測了造模不同時間點(diǎn)大鼠肝臟β-arrestin2、TGF-β1、TβRⅡ、TβRⅢ、CollagenⅠ、CollagenⅢ的表達(dá)變化；體外以TGF-β1刺激的HSC做為膠原產(chǎn)生模型,檢測了TGF-β1刺激不同時間點(diǎn)HSC中β-arrestin2、TβRⅢ、CollagenⅠ、CollagenⅢ的表達(dá)情況及Smad2、Smad3、Akt信號通路的激活情況。采用激光共聚焦、免疫共沉淀、針對TβRⅢ和β-arrestin2的小干擾RNA (small interfering RNA, siRNA),進(jìn)一步探討β-arrestin2對HSC膠原生成的影響及與TPRIII的相互作用情況。目的：體外建立豬血清誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠模型；體外選取大鼠HSC-T6細(xì)胞株,TGF-β1刺激不同時間,并采用TβRⅢ siRNA和β-arrestin2 siRNA干擾。觀察β-arrestin2、TβRⅢ、膠原表達(dá)及相關(guān)信號通路的變化,探討β-arrestin2與TβRⅢ的相互作用,闡明β-arrestin2在HSC膠原產(chǎn)生中的作用及機(jī)制,為防治肝纖維化提供新的靶點(diǎn)。方法：Wistar大鼠腹腔注射無菌豬血清,每周2次,誘導(dǎo)肝纖維化模型。分別于造模第3、6、9、12、16周末次注射24h后處死大鼠。Western blot法檢測肝臟中β-arrestin2、TGF-β1、TβRⅡ、TβRⅢ、CollagenⅠ、CollagenⅢ表達(dá)水平的變化。體外選用HSC-T6細(xì)胞,Western blot法檢測TGF-β1刺激不同時間點(diǎn)(0.25 h、0.5h、1 h、4 h、8 h、12 h)HSC中β-arrestin2、TβRⅢ、CollagenⅠ、CollagenⅢ表達(dá)變化,以及Smad2、Smad3、Akt信號通路的激活情況；分別使用針對TβRⅢ siRNA和β-arrestin2 siRNA轉(zhuǎn)染HSC,采用Western blot法檢測轉(zhuǎn)染后TβRⅢ、β-arrestin2、膠原的表達(dá)變化和Smad2、Smad3、Akt信號通路的激活情況；激光共聚焦和免疫共沉淀檢測β-arrestin2、TβRⅢ的相互作用。結(jié)果：1.豬血清誘導(dǎo)的肝纖維化模型大鼠肝臟中β-arrestin2、TGF-β1、TβRⅡ、TβRⅢ、 Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表達(dá)情況Western blot檢測結(jié)果顯示,肝臟Collagen Ⅰ、CollagenⅢ的表達(dá)隨肝纖維化的.形成增高,β-arrestin2的表達(dá)也逐漸增高：同時,隨造模時間的延長TGF-β1的表達(dá)升高,而TβRⅢ隨之降低,TβRⅡ則無明顯變化。相關(guān)性分析結(jié)果表明,Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ與β-arrestin2的表達(dá)呈正相關(guān),而TβRⅢ與β-arrestin2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。2. TGF-β1刺激的HSC中β-arrestin2、TβRⅢ、CollagenⅠ、CollagenⅢ的表達(dá)變化,以及Smad2、Smad3和Akt信號通路的激活情況Western blot檢測結(jié)果顯示,TGF-β1刺激HSC不同時間點(diǎn)(0.25 h、0.5 h、1 h、4 h、8 h、 12 h),β-arrestin2的表達(dá)隨著TGF-β1的刺激時間延長而升高,TβRⅢ表達(dá)降低。Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表達(dá)也明顯升高。p-Smad2、p-Smad3分別在0.5h和0.25h表達(dá)最高,p-Akt在4h達(dá)到最高。3. TβRⅢ siRNA轉(zhuǎn)染HSC后TβRⅢ、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表達(dá)變化為了研究TβRⅢ在HSC中的作用,向HSC轉(zhuǎn)染了針對TβRⅢ的siRNA。 Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染TβRⅢ siRNA后,與對照組相比,HSC中TβRⅢ表達(dá)下降,而TGF-β1刺激的Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表達(dá)升高。4. TβRⅢ siRNA轉(zhuǎn)染HSC后Smad2、Smad3和Akt信號通路的激活情況進(jìn)一步研究TβRⅢ對TGF-β1激活的信號通路的影響,Western blot檢測了Smad2、Smad3和Akt的激活情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染TβRⅢ siRNA后,與對照組相比,可明顯促進(jìn)TGF-β1刺激的HSC中Smad2、Smad3和Akt信號通路的激活。5. β-arrestin2、siRNA對HSC中β-arrestin2、Collagen Ⅰ、CollagenⅢ表達(dá)的影響為了研究β-arrestin2對HSC膠原產(chǎn)生的影響,向細(xì)胞轉(zhuǎn)染了β-arrestin2 siRNA。 Western blot檢測發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染β-arrestin2 siRNA后,與對照組相比,TGF-β1刺激的HSC中Collagen Ⅰ、CollagenⅢ的表達(dá)下降。6. β-arrestin2 siRNA轉(zhuǎn)染HSC對Smad2、Smad3和Akt信號通路激活的影響Western blot檢測發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染β-arrestin2 siRNA后,與對照組相比,TGF-β1刺激的HSC中p-Smad2、p-Smad3和p-Akt的表達(dá)下降,而Smad2、Smad3和Akt的表達(dá)沒有明顯變化。7. TGF-β1刺激的HSC中β-arrestin2與TβRⅢ的相互作用激光共聚焦與免疫共沉淀結(jié)果顯示,β-arrestin2與TβRⅢ在TGF-β1刺激的HSC中存在共定位,TGF-β1刺激后,β-arrestin2與TβRⅢ共沉淀增強(qiáng)。轉(zhuǎn)染β-arrestin2 siRNA后,與對照組相比,細(xì)胞中TβRⅢ表達(dá)升高,但TβRⅢ和β-arrestin2的共沉淀作用無明顯變化。提示抑制β-arrestin2減弱β-arrestin2與TβRⅢ的相互作用,可能上調(diào)了TβRⅢ對Smad和Akt通路的抑制作用。結(jié)論：1.在肝纖維化大鼠造模過程中,Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表達(dá)逐漸升高,β-arrestin2的表達(dá)也增高,而TβRⅢ的表達(dá)減少,TβRⅡ則無明顯變化。相關(guān)性分析結(jié)果提示,在肝纖維化過程中,β-arrestin2的表達(dá)與膠原表達(dá)成正相關(guān),可能在HSC膠原生成的過程中發(fā)揮作用。2. TGF-β1刺激的HSC中,β-arrestin2、Collagen I、Collagen III的表達(dá)升高,TβRIII的表達(dá)降低。β-arrestin2與TβRIII在HSC中存在相互作用,且TGF-β1刺激后相互作用增強(qiáng)。3.HSC轉(zhuǎn)染針對TβRIII siRNA后,膠原相關(guān)蛋白的表達(dá)增高；同時,Smad2、Smad3和Akt信號通路激活水平升高。結(jié)果顯示,降低TβRIII的表達(dá)可能促進(jìn)了Smad2、 Smad3和Akt信號通路的激活,進(jìn)而促進(jìn)了膠原表達(dá)。4.HSC轉(zhuǎn)染針對β-arrestin2 siRNA后,TGF-β1的刺激無法增強(qiáng)β-arrestin2與TβRIII的相互作用,轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中膠原相關(guān)蛋白的表達(dá)被抑制,Smad2、Smad3和Akt信號通路的激活都得到了抑制。以上結(jié)果提示,β-arrestin2可能通過增強(qiáng)與TβRIII的作用,減弱了TβRIII對Smad2/3、Akt通路的抑制作用,進(jìn)而促進(jìn)膠原產(chǎn)生。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R575.2

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本文編號：1296671