本文關(guān)鍵詞：Toll樣受體通路在慢加急肝衰竭患者發(fā)病及Th17細胞活化中的作用研究

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【摘要】：免疫介導炎癥損傷是HBV感染相關(guān)的慢加急性肝衰竭的重要特征。Th17細胞分泌的白介素(IL)17參與肝損傷,其活化被認為在HBV相關(guān)的慢加急肝衰竭的發(fā)病中發(fā)揮了重要作用,但目前對于慢加急肝衰竭中Th17細胞活化的促發(fā)原因仍不十分清楚。對自身免疫性疾病的研究顯示,Toll樣受體通路參與促進Th17細胞的分化形成及疾病的發(fā)生發(fā)展。目前,對于Toll樣受體通路在HBV感染相關(guān)的慢加急性肝衰竭發(fā)病中的作用及其對Thl7細胞分化影響的研究仍為空白。本研究以HBV相關(guān)的慢加急肝衰竭患者為研究對象,系統(tǒng)分析了T細胞上Toll樣受體的表達狀況,比較Toll樣受體與肝損傷指標的相關(guān)性,并探討了Toll樣受體2表達對慢加急肝衰竭患者體內(nèi)Th17細胞活化及其功能的影響。本研究對闡明HBV相關(guān)的慢加急肝衰竭發(fā)病機制及尋找新的免疫治療方案提供重要的線索和理論依據(jù)。 目的 1.本研究通過對Toll樣受體家族中(TLR1-10)在健康對照、HBV感染相關(guān)的慢加急性肝衰竭和慢性乙肝患者外周血單個核細胞上表達狀況和T細胞上TLR2/4表達,全面分析不同研究對象Toll樣受體的表達差異,且比較Toll樣受體的表達與肝損傷參數(shù)和HBV病毒學參數(shù)的相關(guān)性。 2.體外用Toll樣受體2配體(Pam3Csk4)刺激HBV感染相關(guān)的慢加急性肝衰竭及慢性乙肝患者外周血T細胞,檢測刺激前后Th17細胞及分泌細胞因子表達狀況變化,判斷刺激后,TH17細胞表達與臨床生化指標之間的相關(guān)性。 3.縱向觀察體外用Toll樣受體2配體(Pam3Csk4)刺激HBV感染相關(guān)的慢加急性肝衰竭外周血T細胞,檢測Th17細胞及其分泌細胞因子表達變化,分析TLR2及IL-17的表達變化及疾病發(fā)展之間的相關(guān)性,從而探討TLR2在Th17應答及致病之間的作用,為闡明Th17在HBV感染相關(guān)的慢加急性肝衰竭中致病機制提供實驗及理論基礎(chǔ)。 方法 1.本實驗選取協(xié)和感染性疾病科門診或住院診療的44例HBV感染者為研究對象,其中22例為HBV感染相關(guān)的慢加急性肝衰竭(ACLF)患者,22例為慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者。另選取20例健康對照者。本研究獲得武漢協(xié)和醫(yī)院倫理學會批準及所有研究對象均簽訂知情同意書,并排除其它病毒合并感染。 2.受試對象肱靜脈血用肝素鈉抗凝管采取,用Ficoll密度梯度離心法,獲得外周血單個核細胞,分離后的細胞用TRIZOL法提取RNA,用于擴增TLR1-TLR1O基因表達。 3.分離后的部分PBMC在96孔-U-型板上,培養(yǎng)4小時,分別根據(jù)需要加入佛波酯(phorbol-12-myristate13-acetate, PMA),離子霉素(Ionomycin),或佛波酯,離子霉素及TLR2配體(Pam3Csk4, P3C),同時設(shè)加入培養(yǎng)基的孔為陰性對照。培養(yǎng)后細胞通過流式染色技術(shù)檢測CD4+T細胞表面的TLR2表達,經(jīng)穿孔破膜后染色檢測1L-21, IL-22, IL-17, IFN-γ及TNF-a的表達。 4.分離后的部分PBMC在96孔-U-型板上,通過流式染色技術(shù)檢測CD4+T細胞及CD8+T細胞表面TLR2/TLR4表達。 5.通過酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測病毒標志物：乙肝三系；丙肝抗體；艾滋病抗體等 6.臨床生化指標來源于協(xié)和醫(yī)院檢驗科。 7.用統(tǒng)計學軟件SPSS17.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,所用的方法為曼惠特尼U檢驗(Mann-Whitney U test),威氏配對符號秩檢驗(Wilcoxon matched pairs test)斯皮爾曼秩相關(guān)性檢驗(Spearman rank correlation)等,p值0.05認為有顯著差異性。 結(jié)果 1.通過RT-PCR方法檢測慢加急肝衰竭患者、慢性乙肝患者及健康者TLR1-10mRNA的總體表達譜,結(jié)果顯示,與健康對照相比,ACLF患者TLR1/2/4/5/6/10mRNA表達明顯增高,CHB患者TLR1/2/3//4/5/6/8/9/10mRNA表達明顯增高,且TLR2/4表達明顯高于其他TLRs;與慢性乙肝患者相比,ACLF患者TLR2/6mRNA表達明顯增高,而TLR8/9mRNA表達低于CHB患者。 2.將上述HBV感染患者,按照HBeAg+及HBeAg患者分類,比較TLR1-10mRNA總體表達譜,結(jié)果顯示：與健康對照相比,HBeAg+/HBeAg患者TLR2/4/5/6/8/9/10mRNA表達明顯升高,且以TLR2/4表達最高。雖然HBeAg+患(?)TLR2/4/5/6/8/9/10mRNA表達明顯低于HBeAg-患者,但其差異無統(tǒng)計學意義。 3.流式細胞術(shù)檢測慢加急肝衰竭患者、CHB患者及健康者外周血PBMC中CD4+T細胞與CD8+T細胞上TLR2/4的表達,結(jié)果示：CD4+T細胞上TLR2/4表達在ACLF組明顯高于CHB組和健康對照組：CHB組CD4+T細胞上TLR2表達高于健康對照組。CD8+T細胞上TLR2/4表達在ACLF組明顯高于CHB組和健康對照組；CHB組CD8+T細胞上TLR2表達高于健康對照組。 4. TLR1-10mRNA表達水平與臨床生化指標的相關(guān)性分析,結(jié)果顯示：在慢性乙肝患者中,TLR3mRNA表達與HBV DNA表達呈正相關(guān),TLR7mRNA表達與血清ALT水平呈正相關(guān)。 5.HBV感染患者中,CD4+T細胞及CD8+T細胞上TLR2/4表達與臨床指標總膽紅素(total bilirubin, TBIL),直接膽紅素(direct bilirubin, DBIL),堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP),國際標準化值(International Normalized Ratio, INR)呈正相關(guān),與白蛋白(Albumin, ALB)呈負相關(guān)。此外,CD4+T細胞與CD8+T細胞上TLR2表達與谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST),凝血酶原時間(prothrombin time, PT),白細胞(white blood cell, WBC)呈正相關(guān),總蛋白(Total Protein, TP),血小板(platelet, PLT)呈負相關(guān)。CD4+T細胞上TLR4表達與凝血酶原時間(PT)、白細胞(WBC)呈正相關(guān)。 6.慢加急肝衰竭患者PBMC中IL-17mRNA的表達明顯高于慢性乙肝患者及健康對照。 7.慢加急肝衰竭患者PBMC中IL-17mRNA表達與總膽紅素及直接膽紅素呈正相關(guān)。 8.慢加急肝衰竭患者外周血Th17細胞的頻率增加,明顯高于慢性乙肝患者及健康對照組。 9.慢加急肝衰竭患者、慢乙肝患者和健康對照者PBMC在體外用TLR2配體刺激后： 1)慢加急肝衰竭和慢乙肝患者CD4+T細胞上IL17表達明顯增加,但是健康對照組刺激前后IL-17表達沒有統(tǒng)計學差異。 2)Th17細胞分泌的細胞因子(IL-22, IL-21)及促炎因子(IFN-γ, TNF-a)明顯增加,但是在健康對照組沒有統(tǒng)計學差異。 3)慢加急肝衰竭患者上述細胞因子的表達高于慢性乙肝患者和健康對照組,但是IFN-γ的表達沒有統(tǒng)計學差異。 4)慢加急肝衰竭患者Thl7細胞的表達頻率與總膽紅素,直接膽紅素呈正相關(guān),與白蛋白呈負相關(guān)。5)慢加急肝衰竭患者TH17細胞表達頻率與TLR2表達呈正相關(guān)。 10.縱向觀察慢加急肝衰竭患者伴隨病情的發(fā)展,其CD4+T細胞上IL-17及TLR2的表達狀況,顯示：隨著病情的加重,IL-17A的表達與TLR2的表達增加。但是伴隨著病情的好轉(zhuǎn),IL-17/TLR2表達明顯降低。 結(jié)論 1.慢加急肝衰竭患者外周血TLR2/4mRNA表達及TLR2/4蛋白表達水平明顯高于慢性乙肝患者和健康對照組。提示慢加急肝衰竭患者體內(nèi)存在天然免疫的活化及感染的存在。 2.慢加急肝衰竭患者外周血Th17頻率及分泌的細胞因子明顯高于慢性乙肝患者及健康對照組,提示Thl7參與慢加急肝衰竭患者的肝損傷。 3.慢加急肝衰竭患者Th17細胞的表達頻率及分泌的細胞因子,在TLR2配體刺激下明顯增加。Thl7表達與臨床病情重癥指標相關(guān),且TH17細胞表達頻率與TLR2表達呈正相關(guān),提示慢加急肝衰竭患者體內(nèi)Th17細胞的活化的機制可能是TLR2參與啟動Th17細胞的反應,加重對慢加急肝衰竭患者的肝損傷。 本研究的創(chuàng)新點 4.本研究立足于文獻報道的研究成果,充分依據(jù)現(xiàn)有的理論基礎(chǔ),創(chuàng)新性提出將天然免疫(Toll樣受體(TLR2))與獲得性免疫(Th17細胞)為研究對象,研究它們在慢加急肝衰竭患者中表達狀況,及與臨床疾病進展之間的關(guān)系,探討TLR2可能參與Th17細胞在慢加急肝衰竭患者中的致病作用,而有關(guān)這方面的研究目前尚無相關(guān)的研究報道。 5.通過TLR2配體刺激慢加急肝衰竭患者的PBMC,檢測Th17細胞的表達頻率及分泌的細胞因子表達增加,及其與臨床檢測指標的相關(guān)性,為探討慢加急肝衰竭患者Thl7致病機制提供重要的理論基礎(chǔ),為慢加急肝衰竭患者的臨床檢測及治療提供新的靶點。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R575.3

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