本文關鍵詞：廣西肝癌高發(fā)區(qū)和低發(fā)區(qū)HBV基因型分布和全基因變異研究

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【摘要】：研究背景:HBV屬于嗜肝病毒科,是一種長3.2kb的DNA病毒,其為有包膜的環(huán)狀不完全雙鏈DNA。HBV是已知可感染人體的最小的雙鏈DNA病毒,但其復制效率最高。它包含4個部分重疊的開放讀碼框(ORF),pre S1/S2/S,pre C/C,P和X。由于HBV聚合酶缺乏校準功能,導致HBV有很強的序列異質性。核苷酸異質性大于8%是HBV分型的原則,按照此原則HBV可以被分為8個基因型:A-H,新發(fā)現的基因型I和J還存在爭議(未被NCBI在線基因分型工具收錄)。急慢性肝炎,肝硬化和肝癌的發(fā)生都與HBV感染緊密相關,嚴重影響人類健康。HBV是人體中最常見的病原體,全球有20億人既往感染或現癥感染。其中2千5百萬人有慢性乙肝。超過75%的乙肝病人生活在西太平洋和東南亞。中國是HBV感染高發(fā)區(qū),有1千2百萬乙肝病人,其中大約有15%-40%發(fā)展成HBV相關肝硬化和肝癌。每年有大約60萬人死于此類疾病。HBV在中國的分布:北方地區(qū)以C型為主,中南地區(qū)以B型為主,西南地區(qū)B型和C型均等,C/D重組基因型主要分布在西北地區(qū),C2和B2是最多見的亞型。在我國農村,惡性腫瘤中胃癌死亡率最高,其次是肝癌;在城市,肝癌死亡率僅次于肺癌和胃癌死亡率,居第三位,因此其病原生物學、發(fā)病機制及預防和治療是研究的重點內容。廣西扶綏地區(qū)的肝癌發(fā)病率和死亡率均超過50/10萬,遠高于全國平均水平27/10萬。而廣西桂林地區(qū)肝癌發(fā)病率約為29/10萬,與全國水平接近。本課題組既往研究發(fā)現HBV感染、黃曲霉毒素的攝入和飲用水源污染等是廣西扶綏縣肝癌發(fā)生的主要三大環(huán)境危險因素,在黃曲霉毒素的攝入和飲用水污染得到控制后,扶綏縣肝癌仍持續(xù)高發(fā)。目前HBV基因型、亞型以及變異成為其致癌作用研究的重點。為了了解扶綏地區(qū)HBV的生物學特征,現選取肝癌低發(fā)區(qū)桂林的HBV感染者和肝癌患者一同進行對照研究,預期從病毒學角度發(fā)現導致扶綏肝癌持續(xù)高發(fā)的根本原因。目的:(1)建立適用于多種HBV基因型的PCR反應體系并優(yōu)化其反應條件,實現對廣西壯族自治區(qū)內存在的各個基因型HBV全序列的高靈敏度擴增,并確保反應的特異性,為后續(xù)測序工作打下基礎。(2)對扶綏地區(qū)和桂林地區(qū)感染HBV的肝癌和慢性肝炎患者及攜帶者,通過PCR產物直接測序的方法,獲得其血清中HBV序列信息,再使用相應的生物信息學分析軟件對PCR產物進行拼接,獲得HBV全序列。并使用進化樹的方法對全序列進行分型和確定亞型。研究肝癌組和非肝癌組病人HBV突變情況,確定HBV感染相關肝癌的獨立危險因素。(3)對扶綏和桂林地區(qū)可能存在的特有基因型進行分析鑒定。方法:(1)通過文獻檢索和使用引物設計軟件,找到適用于大多數HBV基因型的PCR引物,驗證引物的特異性。同時比較一片段法和兩片段法PCR在HBV全序列擴增中的效果差異,從而選擇最優(yōu)化的方法,確定PCR反應體系和反應條件,使用經熒光定量PCR準確測出HBV DNA含量的標本驗證該PCR反應體系的檢測靈敏度。(2)收集來自扶綏地區(qū)和桂林地區(qū)的肝癌和慢性乙肝患者及HBV攜帶者血清,使用兩片段法結合半巢式PCR,擴增HBV全基因,使用相應的生物信息學分析軟件對PCR產物進行拼接,獲得HBV全序列。并使用NCBI的在線分型工具和分子進化樹的方法對全序列進行分型并確定亞型。按照基因分型分別研究肝癌組和非肝癌組病人的HBV突變情況,使用SPSS進行比較分析,找出肝癌相關突變位點;使用多因素統(tǒng)計分析,確定獨立危險因素,并確定這些突變位點用于肝癌診斷的靈敏度和特異性,并嘗試進行聯合診斷分析。(3)對基因分析得到的重組序列,使用NCBI的BLAST功能找到與重組序列相似的序列,查找文獻原文,了解其分布情況。使用SIMPLOT確定重組位點,找出重組序列來源;分析其全序列與不同基因型標準序列的差異情況、以及S區(qū)氨基酸表達情況,確定重組基因型的分類。結果:(1)通過對30例臨床標本的檢測發(fā)現:兩片段法的檢測靈敏度遠高于一片段法,HBV DNA定量大于1.45×103 IU/ml的標本均可以檢出明顯的產物條帶。故在后續(xù)實驗中確定使用兩片段法進行PCR擴增。同時,將本實驗用到的引物序列與HBV標準序列進行匹配驗證,證明其具有很好的特異性和較強的結合能力。此外,半巢式PCR方法的使用,既提高了檢測靈敏度,又避免了非特異性產物的出現。(2)本研究共收集來自扶綏和桂林地區(qū)的血清標本共339例,按照實驗流程去除資料不全,HBV DNA含量過低及測序失敗的病例后,共有187例研究對象測得HBV全基因序列。經NCBI基因分型工具鑒定分型,獲得本地區(qū)HBV B型和C型的參考序列。扶綏地區(qū)的受試者中,C基因型占77.1%,B基因型占18.8%,重組基因型占4.2%。桂林地區(qū)的標本中C基因型占21.8%,B基因型占78.2%。兩地HBV基因型分布存在顯著差異。在全部受試者中,HBV B型有86例,其中B2占88.4%(75/86),B4占11.6%(11/86);HBV C型有93例,其中C1占69.9%(65/93),C2占9.7%(9/93),C5占20.4%(19/93)。扶綏地區(qū)以C1,C5亞型為主,B2,C2,B4次之。桂林地區(qū)以B2占絕對多數,C1,C5,B4,C2次之。多因素統(tǒng)計分析結果顯示:男性,年齡大于50歲,HBV C基因型感染分別是HCC發(fā)病的獨立危險因素。將全部研究對象按照基因型分組,分別研究肝癌組和非肝癌組的HBV全基因序列,將超過10%的研究對象出現突變的位點定義為突變熱點。B型有147個突變熱點,C型有249個突變熱點,將這些突變位點分為肝癌組和非肝癌組進行研究和分析,B型中有20個位點有統(tǒng)計學差異,C型有17個位點有統(tǒng)計學差異。經過多因素統(tǒng)計分析,在C基因型中發(fā)現3組位點突變(T53C,A1762T/G1764A,G1775A)是肝癌發(fā)生的獨立危險因素,三者聯合診斷將有助于提高診斷效能。(3)本課題組發(fā)現編號為414,441,533,678的四例標本經NCBI基因分型工具確定為A,C,G重組基因型,在GENEBANK中找到與其相近的HBV全序列進行進化樹分析,發(fā)現其不屬于目前已有的分型;經查看參考文獻,發(fā)現近年有文獻報道類似的HBV全序列,有學者將其命名為基因型I,對本研究的標本進行全序列分析及S區(qū)氨基酸分析均支持將其分為新的基因型。時間樹分析發(fā)現該新的基因型I分化年代約在1200年前。結論:(1)本課題組結合已有文獻和引物設計工具,找到了一種能夠對HBV全基因進行高保真PCR的方法,該實驗方法能夠保證檢測的高靈敏度和高特異性,具有廣泛的應用前景。(2)對來自扶綏和桂林的183例肝癌和非肝癌病人的血清標本的HBV全序列分析,我們研究發(fā)現了肝癌高低發(fā)區(qū)的HBV基因型和基因亞型分布存在顯著差異;建立的B和C型參考序列為后續(xù)的研究提供了參考;發(fā)現的肝癌相關突變位點將為后續(xù)的肝癌早診早治工作提供幫助。(3)經過多序列比對和生物進化分析,本研究發(fā)現的四例HBV重組基因型最終確定為基因型I,這是在廣西扶綏首次報道該基因型的存在,這完善了該基因型分布的地域資料并為NCBI基因分型工具提供了補充。
【關鍵詞】：HBV 肝癌 全基因 突變 基因型
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7;R512.62
【目錄】：

• 個人簡歷3-6
• 中文摘要6-11
• 英文摘要11-19
• 前言19-28
• 第一部分 HBV全序列檢測方法的建立28-45
• 1. 材料和方法29-32
• 2. 結果32-42
• 3. 討論42-45
• 第二部分 廣西肝癌高低發(fā)區(qū)HBV分布差異及不同基因型致癌突變位點的篩選45-89
• 1. 材料和方法45-52
• 2. 結果52-79
• 3. 討論79-89
• 第三部分 廣西扶綏HBV基因型Ⅰ的發(fā)現及其進化分析89-101
• 1. 材料和方法90
• 2. 結果90-98
• 3. 討論98-101
• 全文總結及創(chuàng)新點101-102
• 參考文獻102-124
• 附錄124-125
• 文獻綜述125-149
• 參考文獻137-149
• 致謝149-151

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本文編號：1134309