本文關(guān)鍵詞：缺氧對(duì)LIMK1介導(dǎo)的cofilin磷酸化的影響及其在腸上皮屏障功能損害中的作用研究

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【摘要】：腸上皮屏障功能損害及通透性增加是嚴(yán)重?zé)齻缙跇O其重要的病理生理變化,但其分子機(jī)制至今仍未完全清楚。既往的研究表明,腸上皮細(xì)胞間的緊密連接(tight junction,TJ)通過(guò)其相關(guān)蛋白如ZO-1、Occludin、Claudin等與細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白(actin)相連形成信號(hào)互通,在維持腸上皮屏障功能完整性中發(fā)揮著重要作用。在相關(guān)信號(hào)刺激下,細(xì)胞骨架蛋白活動(dòng)引起細(xì)胞回縮,緊密連接蛋白功能失調(diào),細(xì)胞間TJ受損,細(xì)胞間隙形成,導(dǎo)致通透性增加。因此,腸上皮細(xì)胞TJ蛋白如ZO-1、Occludin、Claudin等與骨架肌動(dòng)蛋白相互作用可能在燒傷后腸上皮屏障功能損害的發(fā)生中具有重要作用。絲切蛋白(cofilin)是一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白,在肌動(dòng)蛋白的聚合與解聚調(diào)控中具有關(guān)鍵作用。Cofilin活化能引起肌動(dòng)蛋白解聚增加,從而調(diào)控F-肌動(dòng)蛋白(F-actin)與G-肌動(dòng)蛋白(G-actin)的動(dòng)態(tài)平衡。同時(shí),Cofilin活性又受到上游分子LIM激酶(LIMK)的調(diào)控,LIMK是一類具有絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸雙重活性的激酶,能使其底物分子cofilin的Ser3位點(diǎn)發(fā)生磷酸化,從而調(diào)控cofilin活性。因此,我們假設(shè)嚴(yán)重?zé)齻缙谑苎踝杂苫黾印TP減少、細(xì)胞內(nèi)Ca2+變化等諸多影響因素,有可能通過(guò)對(duì)LIMK的調(diào)控,引起腸上皮細(xì)胞cofilin活性變化,肌動(dòng)蛋白動(dòng)態(tài)平衡失調(diào),影響TJ結(jié)構(gòu),導(dǎo)致腸上皮屏障功能損害及通透性增加。據(jù)此,本課題擬通過(guò)體外實(shí)驗(yàn),建立腸上皮細(xì)胞單層模型,研究LIMK/cofilin/F-actin通路在缺氧條件下腸上皮屏障功能損害及通透性變化中的作用,以進(jìn)一步闡明嚴(yán)重?zé)齻缙谌毖毖鯐r(shí)腸上皮屏障功能損害的分子機(jī)制。一、方法1.培養(yǎng)人腸上皮細(xì)胞株Caco-2,將Caco-2細(xì)胞種植于Transwell建立腸上皮細(xì)胞單層模型。細(xì)胞分為正常對(duì)照組(缺氧0h)、缺氧1、2、6、12和24h組,細(xì)胞缺氧是在1%O2條件下進(jìn)行。2.采用生物電阻測(cè)定儀檢測(cè)跨上皮細(xì)胞電阻(TER),以反映腸上皮細(xì)胞單層的屏障功能完整性;用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的葡聚糖(FITC-dextran)示蹤法檢測(cè)腸上皮細(xì)胞單層通透性的變化。3.用間接免疫熒光法分別檢測(cè)細(xì)胞TJ蛋白ZO-1、Occludin及claudin-1分布的變化,Western blot法分別檢測(cè)細(xì)胞TJ蛋白ZO-1、Occludin及claudin-1蛋白表達(dá)的變化。4.采用熒光法分別檢測(cè)細(xì)胞F-actin的分布和F-actin/G-actin含量比值的變化。5.采用Western blot法分別檢測(cè)cofilin、p-cofilin、LIMK1及p-LIMK1蛋白表達(dá)的變化。二、結(jié)果1.缺氧引起腸上皮細(xì)胞單層TER明顯下降,通透性顯著增加,以缺氧6h變化最明顯。2.缺氧對(duì)腸上皮細(xì)胞單層TJ蛋白Occludin及Claudin-1蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響,但引起ZO-1的蛋白表達(dá)降低,并引起ZO-1、Occludin及Claudin-1分布明顯改變。3.缺氧后腸上皮細(xì)胞單層F-actin形態(tài)分布明顯改變,細(xì)胞回縮,F-actin/G-actin含量比值明顯降低。4.缺氧后腸上皮細(xì)胞單層cofilin蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化,但p-cofilin蛋白表達(dá)顯著降低,cofilin磷酸化水平明顯下降。5.缺氧對(duì)腸上皮細(xì)胞單層LIMK1蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響,但引起p-LIMK1蛋白表達(dá)顯著降低,LIMK1磷酸化水平明顯下降。三、結(jié)論缺氧能明顯引起腸上皮細(xì)胞單層屏障功能損害及通透性增加,其分子機(jī)制可能是缺氧通過(guò)抑制腸上皮細(xì)胞LIMK1磷酸化而引起cofilin磷酸化水平降低及活性增加,導(dǎo)致細(xì)胞骨架F-actin解聚,破壞F-actin/G-actin動(dòng)態(tài)平衡,從而改變TJ蛋白ZO-1、Occludin及Claudin-1的分布。
【關(guān)鍵詞】：缺氧 腸上皮屏障功能 通透性 絲切蛋白 LIM激酶1 纖維狀肌動(dòng)蛋白 球狀肌動(dòng)蛋白 緊密連接
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R574;R644
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-5
• 英文摘要5-8
• 中文摘要8-10
• 前言10-13
• 1 材料和方法13-19
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果19-32
• 3 討論32-36
• 全文結(jié)論36-37
• 參考文獻(xiàn)37-40
• 文獻(xiàn)綜述 Intestinal tight junction barrier dysfunction in severe burn injury40-66
• References56-66
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果66-67
• 致謝67

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 陳傳莉;劉依凌;王裴;孫瑋;王鳳君;;嚴(yán)重?zé)齻竽c黏膜肌球蛋白輕鏈磷酸化表達(dá)改變及其意義[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2008年15期

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本文編號(hào)：1108238