本文關(guān)鍵詞：藥物性肝損傷體外篩選模型和何首烏致肝損傷的初步研究

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【摘要】：藥物性肝損傷(Drug-induced liver injury, DILI)常常是藥物研發(fā)失敗、上市后被撤市或限制使用的主要原因之一。因此,無(wú)論是上市前還是上市后,對(duì)有肝損傷風(fēng)險(xiǎn)的藥物,建立有效、靈敏、特異的體外DILI篩選模型顯得尤為重要。何首烏作為傳統(tǒng)補(bǔ)益類中藥的一種,使用十分廣泛。藥物不良反應(yīng)數(shù)據(jù)顯示,它具有明顯的肝損傷風(fēng)險(xiǎn)。雖然國(guó)內(nèi)外近年來(lái)進(jìn)行了一些基礎(chǔ)性研究,但毒性成分目前仍不清楚。因此,需要對(duì)何首烏致肝損傷毒性成分及其可能的作用機(jī)制進(jìn)行研究。首先,開展五種肝細(xì)胞體外模型的比較研究。選擇對(duì)乙酰氨基酚、卡馬西平、雙氯芬酸鈉、異煙肼、丙戊酸鈉、鹽酸胺碘酮、鹽酸四環(huán)素、利福平、依托泊苷、鹽酸拉貝洛爾、達(dá)那唑、雷公藤甲素、野百合堿和黃獨(dú)素B共14個(gè)藥物為DILI陽(yáng)性對(duì)照,鹽酸班布特羅、鹽酸丁螺環(huán)酮和丁溴酸東莨菪堿共3個(gè)藥物為DILI陰性對(duì)照,采用CCK-8細(xì)胞毒性篩選、高內(nèi)涵篩選和肝相關(guān)生化指標(biāo)篩選等方法,對(duì)L-02、 HepG2、 HepaRG和hiHeps等四種人源肝細(xì)胞系和一種原代大鼠肝細(xì)胞(Primary rat liver cells, PRLs)進(jìn)行比較研究。結(jié)果表明,HepaRG肝細(xì)胞系鑒別DIIL藥物的能力最高,并依鑒別DILI藥物的能力將其排序?yàn)镠epaRG L-02 HepG2= hiHeps PRLs. HepaRG肝細(xì)胞在檢測(cè)氧化應(yīng)激、線粒體損傷以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等方面靈敏性較高,呈劑量依賴性,優(yōu)于其他四種肝細(xì)胞。在相關(guān)性分析和顯著性檢驗(yàn)中,谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase, AST)、乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase, LDH)、蘋果酸脫氫酶(Malate dehydrogenase, MDH)可同時(shí)反映雙氯芬酸鈉、鹽酸丁螺環(huán)酮和達(dá)那唑?qū)epaRG肝細(xì)胞的影響,提示可以作為探索DILI藥物的肝損傷相關(guān)生物標(biāo)志物。其次,對(duì)何首烏致肝損傷成分進(jìn)行研究。一方面,我們對(duì)何首烏藥材進(jìn)行提取和分離,得到何首烏70%總醇提物和8個(gè)提取組分；另一方面,選擇易于獲得的何首烏所含的16個(gè)單體成分作為研究對(duì)象。采用CCK-8細(xì)胞毒性篩選、UPLC-PAD含量測(cè)定以及肝相關(guān)生化指標(biāo)測(cè)定等方法,對(duì)何首烏70%總醇提物、8個(gè)提取組分和16個(gè)單體成分進(jìn)行毒性組分和毒性成分的研究。結(jié)果表明,第四組分(Fraction 4, Fr.4)可能為何首烏致肝損傷的毒性組分,沒食子酸、白藜蘆醇、大黃素、大黃酸為何首烏中具有明顯細(xì)胞毒性的單體成分。結(jié)合L-02肝細(xì)胞損傷特征分析和含量分析,推測(cè)沒食子酸可能是何首烏致肝損傷的主要成分之一。此外,谷氨酸脫氫酶(Glutamate dehydrogenase, GLDH)和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(y-Glutamyl transferase, y-GT)都反映何首烏70%總醇提物和沒食子酸對(duì)肝細(xì)胞的損傷作用。最后,對(duì)沒食子酸致肝細(xì)胞損傷的初步機(jī)理進(jìn)行研究。分別從細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、高內(nèi)涵篩選(活性氧、線粒體膜電位、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、中性脂代謝和鈣離子穩(wěn)態(tài))、二維凝膠電泳技術(shù)結(jié)合分子生物學(xué)驗(yàn)證,探索沒食子酸在不同劑量和不同時(shí)間下對(duì)HepaRG肝細(xì)胞損傷的機(jī)理。結(jié)果表明,沒食子酸對(duì)HepaRG肝細(xì)胞的細(xì)胞周期沒有顯著影響;沒食子酸呈劑量依賴性的誘導(dǎo)HepaRG肝細(xì)胞凋亡；沒食子酸呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性的誘導(dǎo)HepaRG肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、降低細(xì)胞內(nèi)活性氧水平和鈣離子濃度,對(duì)線粒體膜電位和中性脂代謝沒有顯著影響；沒食子酸(0.5mM)在不同時(shí)間(24h和48h)處理HepaRG肝細(xì)胞,共篩選出11個(gè)差異蛋白,其中24h組有6個(gè)差異蛋白,48h組有5個(gè)差異蛋白。結(jié)合GO和Pathway分析,發(fā)現(xiàn)24h處理組主要集中在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中功能蛋白的折疊和加工方面,48 h處理組主要集中在功能蛋白折疊加工、功能蛋白前體RNA核糖核酸的調(diào)控、炎癥過(guò)程、宿主防御等方面；分子生物學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶(Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase A, PPIA)的蛋白表達(dá)一致性和基因水平表達(dá)的一致性,推測(cè)PPIA可能是沒食子酸潛在的調(diào)控靶點(diǎn)。結(jié)論：HepaRG在鑒別DILI藥物方面優(yōu)于其他四種肝細(xì)胞(L-02、 HepG2、 hiHeps和PRLs肝細(xì)胞)；AST、LDH和MDH可以作為在體外反映DILI藥物肝損傷作用的潛在生物標(biāo)志物。沒食子酸可能為何首烏致肝損傷的主要成分之一,其機(jī)制可能是通過(guò)抑制PPIA的轉(zhuǎn)錄和翻譯,引起功能蛋白的錯(cuò)誤折疊和加工,造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,進(jìn)而導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：藥物性肝損傷 HepaRG細(xì)胞系 生物標(biāo)志物 何首烏 沒食子酸 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R575
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• Abbreviations9-11
• 前言11-17
• 第一章 藥物性肝損傷體外模型的篩選17-58
• 第一節(jié) 肝細(xì)胞的制備和培養(yǎng)17-24
• 第二節(jié) CCK-8細(xì)胞毒性篩選24-32
• 第三節(jié) 高內(nèi)涵篩選32-41
• 第四節(jié) 肝相關(guān)生化指標(biāo)篩選41-55
• 討論55-57
• 結(jié)論57-58
• 第二章 何首烏致肝損傷毒性成分的篩選58-94
• 第一節(jié) 何首烏70%總醇提物和8個(gè)組分的制備以及16個(gè)單體成分的購(gòu)置58-61
• 第二節(jié) CCK-8細(xì)胞毒性篩選61-71
• 第三節(jié) 大黃素、大黃酸、白藜蘆醇和沒食子酸的含量測(cè)定71-79
• 第四節(jié) 肝相關(guān)生化指標(biāo)篩選79-89
• 討論89-93
• 結(jié)論93-94
• 第三章 何首烏致肝損傷成分的作用機(jī)制研究94-148
• 第一節(jié) 細(xì)胞周期檢測(cè)94-97
• 第二節(jié) 細(xì)胞凋亡檢測(cè)97-103
• 第三節(jié) 高內(nèi)涵篩選103-108
• 第四節(jié) 二維凝膠電泳分析108-120
• 第五節(jié) Western blot驗(yàn)證120-131
• 第六節(jié) q-RT-PCR驗(yàn)證131-145
• 討論145-147
• 結(jié)論147-148
• 第四章 研究總結(jié)148-150
• 參考文獻(xiàn)150-158
• 綜述158-171
• 參考文獻(xiàn)166-171
• 博士在讀期間所獲成果171-172
• 致謝172-173
• 附錄173-231

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 宋海波;杜曉曦;郭曉昕;任經(jīng)天;楊樂;逄瑜;;基于中醫(yī)藥古籍的何首烏安全性及風(fēng)險(xiǎn)因素分析[J];中國(guó)中藥雜志;2015年05期

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本文編號(hào)：1105062