發(fā)布時間：2017-10-18 02:44

  本文關(guān)鍵詞：幽門螺桿菌感染對胃黏膜上皮細胞DNA損傷修復(fù)機制的影響

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【摘要】：背景與目的:胃癌是全球常見的惡性腫瘤之一。最新全球癌癥的流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明:全球胃癌男、女性新發(fā)病人數(shù)分別占癌癥的第4位和第5位,男、女胃癌病死率分別占癌癥相關(guān)死亡的第3位和第5位。我國是胃癌發(fā)病大國,全球每年新發(fā)胃癌半數(shù)以上在中國。大多數(shù)胃癌病例確診時已處晚期,治療方法有限、預(yù)后不佳。明確胃癌的發(fā)生機制,制定有效的胃癌一級預(yù)防策略迫在眉睫。DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand breaks,DSBs)是一種最嚴重的DNA損傷形式,其精確修復(fù)依賴于DNA損傷信號通路的激活傳遞及各種修復(fù)蛋白的協(xié)同發(fā)揮功能。細胞自噬對基因組穩(wěn)定亦發(fā)揮重要作用,細胞自噬的缺陷可通過影響DNA損傷修復(fù)過程中關(guān)鍵蛋白的活性導(dǎo)致DNA修復(fù)異常。DNA損傷修復(fù)機制的缺陷易引起基因組的不穩(wěn)定,而這種基因組的不穩(wěn)定性毫無疑問對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著十分重要的促進作用。目前認為,幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)感染是慢性非萎縮性胃炎→萎縮性胃炎→腸上皮化生→異型增生→胃癌這一演變過程的始動因素,然而其確切致癌機制尚不清楚。Hp感染是否可誘導(dǎo)胃黏膜上皮細胞發(fā)生DSBs?DNA損傷反應(yīng)信號通路及細胞自噬如何變化?Hp感染是否可以通過干擾DNA的修復(fù)機制進而導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性,引起細胞生物學(xué)功能的異常......?本研究將針對以上問題進行探討,為闡明Hp的致癌機制提供新的理論依據(jù)。材料與方法:(一)Hp感染誘導(dǎo)胃黏膜上皮細胞DSBs的體內(nèi)外研究:1.收集慢性非萎縮性胃炎(chronic non-atrophic gastritis,CNAG)、腸上皮化生(intestinal metaplasia,IM)、異型增生(dysplasia,Dys)和胃癌(gastric cancer,GC)組織,通過免疫組化檢測各病變階段γH2AX(DSBs的檢測指標)的表達,并分析其與Hp感染的關(guān)系;2.通過建立Hp活菌體外與GES-1細胞共培養(yǎng)細胞模型,Western blot檢測γH2AX的表達,中性單細胞凝膠電泳實驗檢測DSBs;3.構(gòu)建Hp感染蒙古沙鼠動物模型,免疫組化檢測胃黏膜組織γH2AX的表達。(二)Hp感染對DNA損傷修復(fù)信號通路及細胞自噬的影響:1.免疫組化檢測不同病變階段胃黏膜標本DNA損傷修復(fù)通路、細胞自噬相關(guān)蛋白的表達,并分析其與Hp感染的關(guān)系;2.檢測Hp活菌體外與GES-1細胞共培養(yǎng)后DNA損傷修復(fù)通路、細胞自噬相關(guān)指標的變化;3.利用Ad-m RFP-GFP-LC3腺病毒檢測Hp活菌作用GES-1細胞后自噬流的變化;4.流式細胞術(shù)檢測Hp活菌與GES-1細胞培養(yǎng)后細胞周期變化;5.Hp活菌與Rad51過表達或敲除的GES-1細胞共培養(yǎng),檢測DSBs及相關(guān)指標的變化。(三)細胞自噬對Hp誘導(dǎo)GES-1細胞DSBs損傷修復(fù)的影響:1.Hp活菌與自噬干預(yù)后GES-1細胞共培養(yǎng),檢測DSBs及相關(guān)指標、Rad51的表達和細胞周期的變化;2.同時干預(yù)GES-1自噬水平及Rad51表達水平,觀察自噬對DNA損傷修復(fù)的調(diào)節(jié)是否依賴于Rad51的表達。結(jié)果:(一)Hp感染誘導(dǎo)胃黏膜上皮細胞DSBs的體內(nèi)外研究:我們通過檢測不同病變階段胃黏膜標本中γH2AX的表達,發(fā)現(xiàn)其在胃黏膜癌變過程中發(fā)揮重要作用,且γH2AX表達與胃癌部位、大體分型、分化程度、腫瘤浸潤深度、TNM分期和淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān),與胃癌預(yù)后呈負相關(guān);進一步分析發(fā)現(xiàn)γH2AX在Hp陽性IM與Dys組織的表達高于Hp陰性組。通過構(gòu)建Hp活菌體外與GES-1細胞共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)Hp感染可誘導(dǎo)GES-1細胞發(fā)生DSBs。進一步在蒙古沙鼠模型進行驗證,發(fā)現(xiàn)Hp感染可誘導(dǎo)蒙古沙鼠胃黏膜上皮細胞γH2AX的高表達。上述實驗結(jié)果提示:Hp體內(nèi)外感染均可誘導(dǎo)胃黏膜上皮細胞發(fā)生DSBs。(二)Hp感染對DNA損傷修復(fù)信號通路及細胞自噬的影響:我們檢測了不同胃黏膜病變階段中DNA損傷修復(fù)通路、細胞自噬相關(guān)蛋白的表達,發(fā)現(xiàn)DNA損傷修復(fù)通路及細胞自噬參與胃黏膜的癌變過程,且與胃癌臨床病理參數(shù)密切相關(guān),其中Beclin-1、p62和BRCA2表達與胃癌預(yù)后呈正相關(guān),而p-ATM(S1981)、Rad51表達與胃癌預(yù)后呈負相關(guān)。進一步分析各病變階段Hp陽性亞組與Hp陰性亞組間的差異,發(fā)現(xiàn):(1)在CNAG和IM病變階段,Hp陽性亞組中p-ATM(S1981)、p-Chk2(T68)、p-p53(S15)的表達均高于Hp陰性亞組;(2)在Dys病變階段,Hp陽性亞組中Rad51的表達低于Hp陰性亞組。在細胞實驗中,我們發(fā)現(xiàn)Hp活菌作用GES-1細胞6h后即可激活DNA損傷反應(yīng)信號通路以及細胞自噬,誘導(dǎo)細胞發(fā)生S期阻滯;但隨著作用時間延長,12h后Rad51蛋白表達和自噬水平均呈下降趨勢;轉(zhuǎn)染Rad51質(zhì)粒對Hp誘導(dǎo)的GES-1細胞DSBs起保護作用,敲除Rad51則作用相反。動物實驗進一步證實,Hp感染12月亞組蒙古沙鼠胃黏膜組織p62表達水平高于對照組;Hp感染18月亞組蒙古沙鼠胃黏膜組織Rad51表達水平低于對照組。上述實驗結(jié)果提示:DNA損傷修復(fù)信號通路在胃黏膜癌變早期發(fā)揮重要的抗癌屏障作用;Hp感染可激活胃黏膜上皮細胞DNA損傷信號通路及細胞自噬,但隨著感染時間延長,Hp感染可下調(diào)自噬水平并導(dǎo)致DNA同源重組修復(fù)能力下降。(三)細胞自噬對Hp誘導(dǎo)GES-1細胞DSBs損傷修復(fù)的影響:我們采用兩種自噬激動(Rapamycin和饑餓處理)及自噬抑制劑(3-MA和Baf A1)對GES-1細胞進行預(yù)處理,后與Hp活菌共培養(yǎng);發(fā)現(xiàn)上調(diào)自噬可促進GES-1細胞Rad51表達,減少DSBs發(fā)生,而抑制自噬則下調(diào)GES-1細胞Rad51表達,并促進DSBs發(fā)生;進一步行補救實驗(即在上調(diào)自噬的同時敲除Rad51或抑制自噬的同時過表達Rad51),發(fā)現(xiàn)細胞自噬對DSBs的保護作用依賴于Rad51的表達。結(jié)論:1.Hp感染可誘導(dǎo)胃黏膜上皮細胞發(fā)生DNA雙鏈斷裂并激活DNA損傷應(yīng)答信號通路;DNA損傷應(yīng)答信號通路的激活在早期胃黏膜癌變過程中發(fā)揮重要抗癌屏障作用。2.Hp感染可通過抑制細胞自噬水平,降低Rad51表達,進而影響胃黏膜上皮細胞DNA損傷修復(fù)機制。
【關(guān)鍵詞】：幽門螺桿菌 DNA損傷應(yīng)答 細胞自噬 Rad51
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R573;R735.2
【目錄】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-14
• 中英縮略詞表14-15
• 第1章 引言15-18
• 第2章 Hp感染誘導(dǎo)胃黏膜上皮細胞DSBs的體內(nèi)外研究18-49
• 2.1 實驗材料18-27
• 2.1.1 臨床組織標本及資料收集18
• 2.1.2 標準菌株、細胞和實驗動物18-19
• 2.1.3 主要試劑19-21
• 2.1.4 主要儀器21-23
• 2.1.5 主要溶液配制23-27
• 2.2 實驗方法27-38
• 2.2.1 胃黏膜病理組織標本的取材及處理27-28
• 2.2.2 組織切片H&E染色、Giemsa染色和免疫組化檢測 γH2AX表達28-30
• 2.2.3 病理結(jié)果判定和免疫組化染色評分30-31
• 2.2.4 細菌培養(yǎng)31-32
• 2.2.5 GES-1 細胞培養(yǎng)及體外Hp感染GES-1 細胞模型的構(gòu)建32-34
• 2.2.6 Western blot檢測GES-1 細胞中 γH2AX的表達34-36
• 2.2.7 中性單細胞凝膠電泳實驗檢測GES-1 細胞DSBs發(fā)生36
• 2.2.8 Hp感染蒙古沙鼠模型的構(gòu)建36-37
• 2.2.9 蒙古沙鼠胃黏膜標本 γH2AX的表達37-38
• 2.2.10 統(tǒng)計學(xué)分析38
• 2.3 實驗結(jié)果38-46
• 2.3.1 病理標本總體情況38-39
• 2.3.2 不同病變階段胃黏膜標本 γH2AX表達及其與Hp感染的相關(guān)性39-40
• 2.3.3 γH2AX表達與胃癌臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系40-42
• 2.3.4 Hp體外誘導(dǎo)GES-1 細胞DSBs42-44
• 2.3.5 Hp誘導(dǎo)蒙古沙鼠胃黏膜上皮細胞DSBs44-46
• 2.4 討論46-49
• 第3章 Hp感染對DNA損傷修復(fù)信號通路及細胞自噬的影響49-105
• 3.1 實驗材料49-51
• 3.1.1 主要試劑49-50
• 3.1.2 主要儀器50
• 3.1.3 主要溶液配制50-51
• 3.2 實驗方法51-59
• 3.2.1 免疫組化檢測不同病變階段胃黏膜標本DNA損傷修復(fù)通路、細胞自噬相關(guān)蛋白的表達51
• 3.2.2 Hp活菌對GES-1 細胞DNA損傷修復(fù)通路和細胞自噬相關(guān)指標表達的影響51-57
• 3.2.3 免疫組化檢測蒙古沙鼠胃黏膜上皮細胞DNA損傷修復(fù)通路和細胞自噬相關(guān)蛋白的表達57
• 3.2.4 過表達或干擾Rad51對Hp誘導(dǎo)GES-1 細胞DSBs的影響57-59
• 3.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析59
• 3.3 實驗結(jié)果59-101
• 3.3.1 不同病變階段胃黏膜標本DNA損傷修復(fù)通路、細胞自噬關(guān)鍵蛋白的表達及其與Hp感染的關(guān)系59-71
• 3.3.2 DNA損傷修復(fù)通路、細胞自噬關(guān)鍵蛋白的表達與胃癌臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系71-88
• 3.3.3 Hp活菌對GES-1 細胞DNA損傷修復(fù)通路和細胞自噬的影響88-95
• 3.3.4 Hp感染對蒙古沙鼠胃黏膜上皮細胞DNA損傷修復(fù)通路和細胞自噬的影響95-97
• 3.3.5 Rad51在Hp誘導(dǎo)GES-1 細胞DSBs損傷修復(fù)中的作用97-101
• 3.4 討論101-105
• 第4章 細胞自噬對Hp誘導(dǎo)GES-1 細胞DSBs損傷修復(fù)的影響105-120
• 4.1 實驗材料105
• 4.1.2 主要試劑105
• 4.1.3 主要儀器105
• 4.1.4 主要溶液配制105
• 4.2 實驗方法105-106
• 4.2.1 干預(yù)細胞自噬對GES-1 細胞DSBs損傷修復(fù)的影響105-106
• 4.2.2 干預(yù)細胞自噬GES-1 細胞DSBs損傷修復(fù)影響的機制探討106
• 4.2.3 統(tǒng)計學(xué)分析106
• 4.3 實驗結(jié)果106-117
• 4.3.1 細胞自噬對GES-1 細胞DSBs損傷修復(fù)的影響106-111
• 4.3.2 細胞自噬影響GES-1 細胞DSBs損傷修復(fù)的機制111-117
• 4.4 討論117-120
• 第5章 結(jié)論120-121
• 致謝121-122
• 參考文獻122-129
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果129-133
• 綜述133-141
• 參考文獻138-141

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本文編號：1052501