本文關鍵詞：利巴韋林通過增強漿細胞樣樹突狀細胞活化發(fā)揮抗丙型肝炎病毒的作用

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【摘要】：在過去的幾十年中,利巴韋林成為治療慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C,CHC)的主要藥物。與干擾素單獨療法相比,利巴韋林聯合干擾素療法可使持續(xù)病毒學應答(sustained virological response,SVR)顯著上升。隨著DAAs的出現,HCV的治療已進入無干擾素時代。目前DAAs臨床試驗顯示,利巴韋林仍不可或缺。然而,利巴韋林抗HCV的作用機制至今尚不明確。最近研究表明,利巴韋林聯合DAA-sofosbuvir可恢復HCV患者體內內源性IFNa-2的分泌。但是目前尚不清楚哪種細胞類型使得內源性IFNa-2分泌恢復,利巴韋林是否參與此過程。在感染的肝細胞中,HCV的NS3-4A通過清除MAVS和TRIF而阻斷I型干擾素生成。因此,在感染的肝臟中,未感染的肝細胞或其他細胞可能是IFN-I的來源。在這些細胞中,p DCs是人體內IFN-I主要生成細胞。體外研究表明,HCV感染肝細胞可以通過細胞接觸的方式啟動TLR-7介導的p DCs激活,產生大量IFN-I。在HCV患者接受利巴韋林治療的過程中,p DCs會受到HCV感染肝細胞及利巴韋林的作用。因此,我們提出假設,利巴韋林通過調節(jié)p DCs的活化狀態(tài),發(fā)揮抗HCV的作用。本課題將從兩部分展開研究:第一部分利巴韋林調節(jié)p DCs活化狀態(tài)研究。采用p DC-Gen2.2細胞系,首先使用TLR7或TLR9配體R848、Cp GA/B激活p DCs,然后加入不同濃度的利巴韋林,測定不同時間點IFN-a水平及細胞內IFN-a,IFN-β表達水平,觀察利巴韋林對p DCs活化狀態(tài)的調節(jié);使用FACS檢測單個細胞水平IFN-a的變化;使用TLR9配體Cp G A分別作用于PBMCs、p DC-depleted PBMCs,觀察IFN-a分泌情況。為了研究利巴韋林調節(jié)p DCs活化的作用機制,檢測利巴韋林對p DC的IRF-7及其他轉錄因子(IRF-9和STAT1)及ISGs表達的影響;采用p DC-Gen2.2細胞系,刺激前使用IFNAR-Ab處理細胞,觀察IFNAR-Ab對利巴韋林作用的影響;實驗結果如下:所有的配體(R848/Cp GA/Cp GB)均可激活p DC-Gen2.2產生IFN-a。利巴韋林單獨不能刺激該細胞分泌IFN-a,但可使TLR7、TLR9介導的IFN-a分泌增加1倍,并且該作用具有時間依賴性和濃度依賴性;利巴韋林和Cp GA同時刺激p DC-Gen2.2可使IFN-a、IFN-β表達水平升高,但對IFN-γ、IL-29、IL28B表達無影響。使用FACS檢測顯示,在單個細胞水平上,利巴韋林可促使Cp GA介導的IFN-a分泌增加。使用Cp G A刺激PBMCs,可以得到與p DC-Gen2.2一致的結果;但p DCdepleted PBMCs對Cp G A反應性顯著降低。在p DC-Gen2.2細胞中,與IFNAR-Ab未處理組相比,IFNAR-Ab處理組的IFN-a分泌水平普遍降低,但利巴韋林仍可使Cp GA介導的IFN-a分泌增加。在m RNA水平上,利巴韋林使經Cp GA刺激后的p DC-Gen2.2表達IRF-7、IRF-9和STAT1及TRIM22、PKR 5和OAS-1增加。第二部分利巴韋林通過調節(jié)p DCs活化狀態(tài)抑制HCV的研究本部分使用H77S.3/Gluc2A感染細胞,在該感染細胞內HCV RNA可活躍復制,檢測Gluc能反應HCV RNA復制水平。首先檢測該細胞系對不同濃度外源性干擾素的反應性;其次,檢測H77S.3/Gluc2A感染細胞與p DC-Gen2.2共培養(yǎng)能否激活p DC-Gen2.2分泌IFN-a并抑制HCV RNA復制;最后檢測利巴韋林/Cp G A激活的p DC-Gen2.2能否有效抑制H77S.3/Gluc2A感染細胞中HCV RNA的復制,并研究其相關因素。實驗結果如下:10u/ml-1000u/ml干擾素均可有效抑制H77S.3/Gluc2A感染細胞中HCV RNA的復制。在第3天,10u/ml干擾素可抑制HCV RNA復制達50%,100u/ml和1000u/ml也可達到同等抑制水平。利巴韋林單獨不能抑制HCV RNA復制。在H77S.3/Gluc2A感染細胞與p DC-Gen2.2共培養(yǎng)系統(tǒng)中,Cp G A可有效激活p DC-Gen2.2分泌IFN-a,并抑制HCV RNA復制;加入利巴韋林,可使該系統(tǒng)內IFN-a分泌增加,HCV RNA復制抑制效果更明顯。綜上所述,我們發(fā)現利巴韋林單獨不能激活p DC-Gen2.2分泌IFN-a,但是可促使TLR7/TLR9介導的IFN-a表達增加。使用H77S.3/Gluc2A感染細胞,建立H77S.3/Gluc2A感染細胞和p DC-Gen2.2共培養(yǎng)系統(tǒng),我們發(fā)現利巴韋林單獨不能抑制HCV RNA復制,但是明顯增強了p DCs抑制HCV RNA復制的功能。這些研究證實了利巴韋林通過增強p DCs活化和IFN-a分泌發(fā)揮抗HCV的作用。
【關鍵詞】：丙型肝炎 利巴韋林 漿細胞樣樹突狀細胞 I型干擾素
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R512.63
【目錄】：

• 前言4-5
• 中文摘要5-8
• Abstract8-15
• 第1章 緒論15-37
• 1.1 利巴韋林在丙肝治療中的重要地位15-24
• 1.1.1 利巴韋林概述15
• 1.1.2 利巴韋林聯合干擾素是治療丙型肝炎的標準方案15-17
• 1.1.3 干擾素及利巴韋林抗病毒作用機制17-21
• 1.1.4 利巴韋林在無干擾素時代仍不可或缺21-24
• 1.2 漿細胞樣樹突狀細胞24-34
• 1.2.1 漿細胞樣樹突狀細胞概述24-30
• 1.2.2 漿細胞樣樹突狀細胞與丙型肝炎30-34
• 1.3 本研究使用HCV-1A細胞系-H77S.3/GLUC2A感染細胞34-35
• 1.4 本研究的目的和意義35-37
• 第2章 利巴韋林調節(jié)漿細胞樣樹突狀細胞活化狀態(tài)的研究37-71
• 2.1 實驗材料37-38
• 2.1.1 細胞株37
• 2.1.2 主要試劑37-38
• 2.1.3 主要儀器38
• 2.2 實驗方法38-51
• 2.2.1 利巴韋林增強TLR7/9 介導的pDC-Gen2.2 細胞激活38-43
• 2.2.2 pDCs是PBMCs中主要的IFN-a分泌細胞43-47
• 2.2.3 利巴韋林增強p DCs活化的作用機制研究47-50
• 2.2.4 統(tǒng)計分析50-51
• 2.3 實驗結果51-67
• 2.3.1 利巴韋林增強TLR7/9 介導的pDC-Gen2.2 細胞激活51-60
• 2.3.2 pDCs是PBMCs中主要的IFN-a分泌細胞60-63
• 2.3.3 利巴韋林增強p DCs活化的作用機制研究63-67
• 2.4 討論67-71
• 第3章 利巴韋林調節(jié)PDCS活化狀態(tài)對HCV復制的影響71-83
• 3.1 材料和方法71-72
• 3.1.1 細胞株71
• 3.1.2 主要試劑71
• 3.1.3 主要儀器71-72
• 3.2 實驗方法72-76
• 3.2.1 檢測H77S.3/Gluc2A感染細胞對IFN-a及利巴韋林的敏感性72-74
• 3.2.2 檢測利巴韋林、pDC-Gen2.2 對HCV RNA的影響74-75
• 3.2.3 統(tǒng)計分析75-76
• 3.3 實驗結果76-80
• 3.3.1 利巴韋林對Huh7.5 細胞活力的影響76
• 3.3.2 H77S.3/Gluc2A感染細胞對IFN-a及利巴韋林的敏感性76-78
• 3.3.3 利巴韋林/Cp GA、pDC-Gen2.2 對HCV RNA影響78-80
• 3.4 討論80-83
• 結論83-85
• 本實驗創(chuàng)新點85-87
• 參考文獻87-104
• 作者簡介及在學期間所取得的科研成果104-105
• 致謝105

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