本文關鍵詞：電刺激促進肌衛(wèi)星干細胞增殖的信號通路研究

  更多相關文章： 電刺激 C_2C_(12) 頦舌肌 肌衛(wèi)星細胞 細胞增殖 信號通路

【摘要】：研究背景及意義：阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome,OSAHS)是耳鼻喉科一種常見的睡眠呼吸障礙疾病。咽喉氣道狹窄或者肌肉松弛是其主要原因,患者表現(xiàn)為夜間睡眠過程中反復發(fā)生上氣道阻塞或塌陷,導致低通氣或者呼吸暫停,從而引起低氧血癥或者高碳酸血癥等。其發(fā)病機制復雜,可并發(fā)多種疾病,具有嚴重的潛在危險性。既往臨床上治療OSAHS的方法包括手術及藥物治療,根據(jù)學者們的研究發(fā)現(xiàn),并非所有的OSAHS患者都可以通過手術來解決問題的,Frideman[3]分級可以有效預鋇OSAHS患者的手術結(jié)果從而指導治療,對于Frideman分級為I期的患者,手術療效可以達到80.6%,II期的患者手術療效為37.9%,而Ⅲ期的患者手術療效直接降至8%,故對于分級為Ⅲ、Ⅳ期的患者來說,手術是毫無意義的。那么對于這一類無法通過手術治療的Frideman Ⅲ、Ⅳ期的OSAHS患者來說,目前最為推崇的經(jīng)典而有效的方法為持續(xù)氣道正壓通氣(continuous positive airway pressure,CPAP),但是由于CPAP需要患者每晚佩戴面罩并且有噪音等,嚴重影響患者及家屬的休息,所以即使療效顯著,也依然難以被廣大患者所接受,拒絕接受CPAP治療的患者百分比竟高達40-50%。直至21世紀初,隨著對OSAHS的發(fā)病機制、解剖學研究的不斷深入了解及探討,加之實驗室診療設備的迅猛發(fā)展,舌下神經(jīng)刺激(hypoglossal nervestimulation,HGNS)于2001年開始進入臨床試驗,但至今仍未能應用于臨床。在更早期,Miki等在20世紀80年代初就行了相關研究,他應用針刺電極,刺激清醒狀態(tài)下的實驗犬的頦舌肌,并證實,刺激上氣道擴張肌能穩(wěn)定及增大咽腔,進而達到治療OSAHS的目的。頦舌肌,是最重要的上氣道擴張肌,起于上頦棘,扇形的肌纖維,向后分散,大部分肌纖維止于舌尖、舌背,少量止于舌骨體的前上緣,主要負責舌之運動,頦舌肌收縮可牽拉舌體向?qū)?cè)偏移以及向前運動,從而擴大咽腔,維持上氣道開放,故頦舌肌也被美稱為上氣道的“安全肌”。當頦舌肌的功能下降,無法抵抗上氣道吸氣負壓時,可致口咽氣道塌陷,進而引起睡眠呼吸暫停或低通氣。而頦舌肌雖是骨骼肌,卻又與一般的骨骼肌不盡相同,與其他骨骼肌相比,頦舌肌的血供豐富,肌纖維含量相對較少,收縮也更迅速,所以更易發(fā)生松弛和疲勞,不適合持續(xù)而強烈的收縮。所以臨床上可以通過功能性的電刺激頦舌肌,使其規(guī)律收縮,達到治療OSAHS的目的。目前對頦舌肌進行肌肉電刺激的研究也僅僅限于實驗室,Odeh等對已麻醉的實驗犬的咽部擴張肌進行研究后,發(fā)現(xiàn)刺激頦舌肌的機械效應相對于刺激其他肌肉更顯著,并且與頭位無關。Oliven等人則通過研究發(fā)現(xiàn),刺激舌下神經(jīng)和刺直接刺激犬的頦舌肌所產(chǎn)生的結(jié)果相近。因此,用于治療OSAHS的肌肉起搏器應運而生。眾所周知功能性電刺激(functional electrical stimulation FES)在其他領域已得到廣泛應用并獲得成功,如心臟起搏器、膈肌起搏器以及膀胱逼尿肌起搏器等,應用于我們耳鼻咽喉科的電刺激器目前主要有喉起搏器,作為一種新興的治療發(fā)展方向,肌肉起搏器是一種功能性肌肉刺激器,起搏后可刺激肌肉并使之恢復活動的技術。最早由美國的Zealear與Dedo等人第一次將這個概念應用于我們喉科,在一定的實驗室基礎上,1996年Zealeal首次將喉起搏器用于人聲帶麻痹的治療,并且他成功證實了,應用于失神經(jīng)支配的狗的環(huán)杓后肌并使之運動的肌肉起搏器的刺激參數(shù),同樣適用于人的喉內(nèi)肌刺激。隨著肌肉起搏器的應用日漸增多,有關電刺激對肌肉的影響的研究也越來越多。肌衛(wèi)星干細胞作為肌肉再生及修復的重要來源,位于基底膜中,與眾多干細胞一樣,肌衛(wèi)星干細胞也具有不穩(wěn)定性,在不同參數(shù)的電刺激下,肌衛(wèi)星干細胞可能會發(fā)生分化、增殖或者凋亡,我們前期的實驗已經(jīng)確定了能夠促進衛(wèi)星干細胞增殖的電刺激參數(shù)。肌衛(wèi)星干細胞是一種多潛能干細胞,在骨骼肌的損傷、修復和維持中起著十分重要的作用。然而正常情況下,肌衛(wèi)星干細胞是處于靜止狀態(tài)的,只有當肌肉受到損傷,例如失神經(jīng)支配、缺氧、牽拉或電刺激時,肌衛(wèi)星干細胞才會被激活,從而開始增殖分化。肌衛(wèi)星干細胞被激活后開始增殖的機理十分復雜,電刺激下肌衛(wèi)星干細胞進行增殖是通過何種信號通路進行調(diào)節(jié)的目前仍尚未清楚。國內(nèi)外關于該方面的研究也較局限。目前體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)NO/HGF/c-met通路可能參與其信號通路,而促進肌衛(wèi)星干細胞增殖的其他細胞內(nèi)在通路如Wnt通路、Sphingolipid信號通路、Notch信號通路均未見有研究。本研究擬對以上三個體外信號通路進行研究,以期發(fā)現(xiàn)一定的電刺激促進肌衛(wèi)星干細胞增殖的主要作用通路,進而為臨床肌肉起搏器的研發(fā)提供一定的實驗室基礎。目的：以小鼠肢體來源的C2C12細胞系及原代培養(yǎng)的幼年比格犬頦舌肌衛(wèi)星干細胞為研究對象,通過固定電壓、固定刺激時間、固定脈寬,不同頻率的脈沖電刺激培養(yǎng)細胞,從而了解不同模式電刺激下C2C12細胞系以及肌衛(wèi)星干細胞的增殖和分化情況,進一步篩選出肌衛(wèi)星干細胞的電刺激調(diào)控的增殖信號通路。方法：1.取體外培養(yǎng)的肌源性C2C12細胞株, 采用固定電壓(5V)、固定刺激模式、不同頻率(OHz、10Hz、80Hz三組)的串刺激(5s,3s-on,2s-off)刺激細胞72小時,并提取細胞RNA,經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄后,運用qRT-PCR(Quantitative Real-time PCR)觀察細胞增殖情況,從而篩選出電刺激下C2C12細胞增殖的信號通路。2.分別用0.25%的胰蛋白酶消化提純以及Percoll密度梯度離心法兩種方法分離提純比格犬頦舌肌原代肌衛(wèi)星干細胞,并用免疫熒光法分別對兩組原代培養(yǎng)的肌衛(wèi)星干細胞進行鑒定；采用固定電壓(5V)、固定刺激模式、不同頻率(0Hz、80Hz三組)的串刺激(5s,3s-on,2s-off)刺激肌衛(wèi)星干細胞72小時,提取細胞RNA及蛋白,使用qRT-PCR及Western Blot定量／半定量細胞增殖相關分子的表達情況,進而篩選出肌衛(wèi)星干細胞電刺激影響的增殖的信號通路。2.用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析。采用獨立樣本T檢驗分析了解固定刺激電壓、刺激模式,不同刺激頻率的串刺激下,肌衛(wèi)星干細胞的增殖情況。以P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果：1.原代培養(yǎng)的比格犬頦舌肌衛(wèi)星干細胞純度達80%以上。2.C2C12細胞系：在固定電壓(5V)、相同脈寬(1ms)、刺激時間相同的串刺激(5s,3s-on,2s-off)下,刺激頻率為80Hz時, 分化信號分子MyoD和Myc,Wnt信號通路中的分子Cyclin D1、rfz、mfz1、mfz2、mfz3、mfz、mfz6、mfz7、 mfz8及Wnt4、Wnt5a、Wnt7a、Wnt8、Wnt10、Wnt11、lef-1、dvl-1等mRNA相對表達量減少；而Timp1、Timp3及β-catenin的表達量相對增加。10Hz及80Hz時Notch通路的Notch1、Notch2、Notch3、HERP、DEC的mRNA相對表達量增加；Sphingolipid信號通路Sphk1、Sphk2、Sgp11、Slpr1、Slpr2、Slpr5、cadherin、 Pax7的mRNA相對表達量也相應增加。3.頦舌肌衛(wèi)星干細胞：在固定電壓(5V)、相同脈寬(1 ms)、刺激時間相同的串刺激(5s,3s-on,2s-off)下,刺激頻率為80Hz時,qRT-PCR結(jié)果顯示肌衛(wèi)星干細胞并未出現(xiàn)增殖；在低頻刺激10Hz時,肌衛(wèi)星細胞組中,Sphingolipid信號通路中pax7、sgp11、sgpp1、slpr2、slpr3、slpr4、sphk1、sphk2、cadhenin、的mRNA相對表達量相應增加。實驗組及對照組中Pax7灰度比無差別；MyoD的灰度0Hz組是最高,其次是80Hz組,最低為10Hz組。結(jié)論：PERCOLL非連續(xù)密度梯度離心法提純的原代培養(yǎng)的比格犬頦舌肌衛(wèi)星干細胞純度較高。在固定電壓、相同脈寬以及刺激時間相同的串刺激下,頦舌肌衛(wèi)星細胞對高頻、低頻電刺激的反應不同于C2C12,后者在低頻、高頻的電刺激時表現(xiàn)為增殖增加,而前者在低頻、高頻的電刺激下,分化能力減弱；不同頻率的電刺激通過激活了Wnt、Notch、Sphingolipid等三個信號通路使C2C12細胞進入增殖；而在不同頻率電刺激下頦舌肌衛(wèi)星細胞的總體趨勢是分化減弱,這可能是低頻刺激時Notch通路減弱及Sphingolipid增強同時存在的結(jié)果,高頻電刺激時,頦舌肌衛(wèi)星細胞分化減弱,是Notch和Sphingolipid通路同時抑制的結(jié)果。
【關鍵詞】：電刺激 C_2C_(12) 頦舌肌 肌衛(wèi)星細胞 細胞增殖 信號通路
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R766
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 前言15-20
• 材料和方法20-37
• 結(jié)果37-47
• 結(jié)論47-48
• 討論48-53
• 參考文獻53-56
• 縮略詞對照表56-58
• 攻讀學位期間成果58-59
• 綜述59-67
• 參考文獻64-67
• 致謝67-68

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本文編號：990774